本发明属于生物制药制品领域，特别是涉及治疗肿瘤的基因工程自然杀伤细胞产品。
背景技术：
肿瘤的生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四大治疗方法。由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多地目光投到肿瘤的生物治疗上。基因和细胞免疫治疗癌症是肿瘤生物治疗的前沿技术。与化疗、放疗等传统治疗方法相比，具有相对毒副作用小、疗效显著等优势。尤其在过去几年中，医疗界对细胞免疫治疗恶性血液病显示出了很大的兴趣，细胞免疫治疗法和前期化疗和放疗有着非交叉的临床作用，而且副作用小。人们观察到，在接受骨髓移植治疗的各种血液病人中，当病情复发后，接受异体白细胞注入可以达到病情的完全缓解[1-4]。如果在注入前用白细胞介素-2(il-2)处理白细胞，会进一步增强供体白细胞对病人肿瘤细胞的杀伤能力和杀伤范围。自然杀伤细胞(nk)被认为是在供体白细胞对病人肿瘤细胞的杀伤反应中起着决定性作用的一个重要组成部分，是先天抗感染和恶性肿瘤免疫系统的一个重要组成部分[5]。和t细胞作用不同，他们不需要预先的免疫，就可以杀死肿瘤细胞，其杀伤活性，不受主要组织相容性复合体(mhc)的限制。nk细胞的肿瘤细胞杀伤活性是通过多种机制实现的，其中穿孔酯酶途径是最常用的机制。穿孔酯酶破坏肿瘤细胞膜，进而诱导凋亡的细胞死亡。nk细胞所表达的杀伤激活和杀伤抑制受体对肿瘤细胞的识别起着决定性作用[6-9]。杀伤激活受体可以识别肿瘤细胞和病毒感染细胞表面的标记分子，而杀伤抑制性受体可识别mhci类分子。当杀伤激活受体和标记分子啮合后，一个“杀”的信号发送到nk细胞，在正常细胞内这个“杀”信号会受到杀伤抑制受体和i类mhc分子相啮合后所发出的抑制信号的压抑，从而避免不应该发生的副作用。恶性肿瘤细胞往往在mhci类表达上有缺陷，不再和杀伤抑制受体相互作用，不能提供抑制信号，因此，可以被nk细胞所杀死。遗憾的是，大多种恶性肿瘤病人的nk细胞功能受到严重损伤，无法识别恶性肿瘤的目标，丧失了体外生长和杀伤细胞的功能[10]。另外，癌症患者自体nk细胞也会受到“自我”表达的hla抑制，进而失去杀伤恶性肿瘤的功能。和自体nk细胞相比，同种异体nk细胞，将是一个更有前途的细胞免疫治疗产品，也为大规模生产细胞免疫治疗产品提供了可能性。
nk-92(atcccrl-2407)是一纯正的，异体活化的nk细胞株。nk-92细胞缺乏杀伤细胞抑制受体(kir)，具有广谱的血液和实体肿瘤细胞杀伤功能。和lak(淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞相比，nk-92细胞有着更强和更广泛的癌细胞杀伤功能。但是nk-92细胞具有il-2依赖性，会给大规模生产和临床应用带来很多不便。另外，临床使用异体活化的nk细胞也携带着一定的安全隐患(比如：移植物抗宿主病)。为了提高产品的安全性，在注入病人体内前nk细胞免疫产品需要经受微量的放射处理。遗憾的是，在提高安全性的同时，微量放射处理也降低了产品的免疫治疗效果。为了促进nk细胞可以在规范的gmp条件下进行大规模生产、避免在临床上使用nk细胞产品时，还要给病人注射重组il-2蛋白产品，和发生移植物抗宿主病的隐患，目前很有必要开发新的，安全有效的不许要放射处理的基因工程nk细胞产品。
文献
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技术实现要素：
本发明的目的是开发全新的治疗肿瘤的基因工程自然杀伤细胞产品，用于肿瘤的临床治疗。
本发明是通过以下的技术方案来实现的，所述基因工程自然杀伤细胞(nk)产品是通过基因修饰使自然杀伤细胞可以稳定的表达人白细胞介素因子和细胞自杀因子。
进一步地，人白细胞介素因子可以为人il-2或il-15。
进一步地，细胞自杀因子可以为hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶基因(cytosinedeaminase)。
进一步地，自然杀伤细胞可以为人自然杀伤细胞系的任一种。
进一步地，用il-2基因和hsv-tk基因的t2a融合体稳定的基因修饰自然杀伤细胞。
进一步地，基因工程自然杀伤细胞用于制备治疗各种恶性肿瘤的基因细胞药物产品。
进一步地，在gmp条件下采用大规模无血清悬浮培养技术生产。
进一步地，可以用于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、皮下注射、器官注射、胸水内注射或腹水内注射。
本发明的技术方案有益效果在于：本发明公开了构建治疗肿瘤的基因工程自然杀伤细胞产品的方法。所构建的基因工程自然杀伤细胞，nk-sbn细胞，具有良好的抗癌功能和安全性，可以试用于临床癌症治疗。
附图说明
图1为基因工程nk92克隆细胞的il-2的表达情况；
图2为基因工程nk92克隆细胞的tk的表达情况；
图3为基因工程nk92克隆细胞的tk敏感性检测结果；
图4为nk-sbn细胞的体外抗癌细胞效应；
图5为nk-sbn细胞在动物体内的抗癌效应；
图6为nk-sbn细胞和健康者外周血单核细胞(pbmc)的共同培养。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、il-2-t2a-hsv-tk载体基因工程质粒载体的构建和表达
从美国lifetechnologies订购合成了il-2cdna和hsv-tkcdna基因片段的克隆表达质粒。表达质粒是冻干的。将合成的il-2cdna克隆到pcdna3.1/neo(invitrogenv79020)载体内建成了il-2表达质粒载体。将合成的hsv-tkcdna基因片克隆到pcdna3.1/hygro(invitrogenv870-20)载体内建成了自杀基因质粒载体。对il-2cdna和hsv-tkcdna基因片段进行了测序。il-2cdna基因序列请参阅序列表。hsv-tkcdna基因序列请参阅序列表。测序结果证实所合成的il-2和hsv-tk基因序列和理论参考序列是100％的完全符合的。
将从lifetechnologies购买合成的il-2cdnapcdna3.1(+)载体，和hsv-tkcdnapcdna3.1(+)载体分别转化到stbl3e.coli(lifetechnologies,c7373-03)内,用lb培养基在37℃度摇床内过夜培养基因工程质粒转化过的stbl3e.coli，扩增基因工程质粒载体的dna。第二天用qiagen质粒纯化柱(qiaprepspinminiprepkit,27104)，纯化扩增的il-2和hsv-tk基因工程质粒载体。再用ecori(newenglandbiolabs,r0101s)和noti(newenglandbiolabs,r0189s)特异性内切酶同时切割hsv-tk基因质粒和pcdna3.1(+)-il-2载体，在37℃水浴内反应1小时，将hsv-tk基因克隆到pcdna3.1(+)-il-2载体,构建pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk基因工程质粒载体。将构建的pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk基因工程质粒，转化到stbl3e.coli(lifetechnologies,c7373-03),用lb培养基在37℃度摇床内过夜培养基因工程质粒转化过的stbl3e.coli，扩增基因工程质粒载体的dna。第二天用qiagen质粒纯化柱(qiaprepspinminiprepkit,27104)，纯化扩增的pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk基因工程质粒载体。
采用pcr扩增的方法，合成了来自thoseaasignavirus的t2a双链dna基因片段。t2adna基因序列请参阅序列表。在pcr扩增的过程中，在t2adna序列的两端添加了和kpn1特异性内切酶切割pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk质粒相重叠的14bp序列。这相重叠的14bp序列分别为，
5’-agttatcagtcgacggtacc-3’
3’-ccatggcctgtatacgggcc-5’
粗体序列是kpn1特异性内切酶切割位点。
将合成的t2a双链dna基因片段变性和复性，用kpn1特异性内切酶同时切割合成的t2a双链dna片段和pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk质粒dna,用in-fusionhd克隆方法(clontech，638909)将t2a序列克隆到pcdna3.1(+)-il-2-hsv-tk载体内，构建pcdna3.1(+)-il-2-t2a-hsv-tk基因工程质粒载体。
将构建的pcdna3.1(+)-il-2-t2a-hsv-tk基因工程质粒，转化到stbl3e.coli(lifetechnologies,c7373-03),用lb培养基在37℃度摇床内过夜培养基因工程质粒转化过的stbl3e.coli，扩增基因工程质粒载体的dna。第二天用qiagen质粒纯化柱(qiaprepspinminiprepkit,27104)，纯化扩增的pcdna3.1(+)-il-2-t2a-hsv-tk基因工程质粒载体。将纯化的基因工程质粒存放在-20度冰箱备用。
对构建好的pcdna3.1(+)il-2-t2a-hsv-tk基因工程质粒载体做了序列分析检测，基因序列(7036bp)请参阅序列表。测序结果证实所构建的pcdna3.1(+)il-2-t2a-hsv-tk基因序列和理论参考序列是100％的完全符合的。
2、基因工程nk细胞的组建
采用常规的细胞培养方法，培养和扩增nk细胞，比如nk-92(atcccrl-2407)细胞。用同时表达il-2和hsv-tk自杀基因的质粒载体转染nk细胞。质粒载体转染按照lifetechnology的lipofectamine试剂(#11668-019)的推荐方法进行。细胞转染后用含有neomycin的培养液筛选稳定表达il-2和hsv-tk自杀基因的nk细胞，建立初期的细胞群。克隆纯化细胞群最终建立基因工程nk克隆细胞,并长期保存在液氮内，用于进一步的研究和生产。
在添加了12％的牛血清，和150u/ml的重组il-2的amem培养液内培养nk-92(atcccrl-2407)细胞。用lipofectamine试剂(lifetechnology，#11668-019)同时将pcdna3.1(+)il-2-t2a-hsv-tk
质粒载体转染到nk-92细胞内。转染48小时后，将培养液转换为含有neomycin的培养液筛选稳定表达il-2和hsv-tk自杀基因的nk-92细胞。在连续培养30天后，将存活细胞稀释，并转移到96孔板内继续培养。稀释到每个孔内只有一个细胞。
每天在显微镜下观察细胞的生长状况，在必要时更换细胞培养液。经过3个多月的培养，将细胞从96孔板的孔扩增到24孔板的孔内，每个孔内加400微升培养液继续培养扩增。每3-5天更换培养液一次。nk92细胞生长的相对缓慢，在培养了2个多月后，24孔板内有了一定量的细胞，用于扩增到6孔板内。每个孔内加2毫升培养液继续培养扩增。每3-5天更换培养液一次。在培养了1个多月后，将细胞从6孔板，扩增到含有5ml的t-25细胞培养瓶，以便培养到足够量的细胞，用于分析检测和液氮冷藏。总计23个t-25细胞培养瓶，每个克隆细胞单独用一个t-25细胞培养瓶。和以前一样每3-5天更换培养液一次。在培养了1个多月后，每个t-25细胞培养瓶内的细胞浓度相继达到了1.1-1.5x106/ml。从每个t-25细胞培养瓶内取1ml转移到新的t-25细胞培养瓶内继续培养，用于细胞检测。将剩余的细胞，在1000rpm离心，5分钟，将得到的细胞沉淀悬浮在2毫升的液氮冷藏缓冲液内。液氮冷藏缓冲液是在基因工程nk92细胞完整生长培养液内加入10％的dmso配成的。将1ml细胞悬液加入到1个2毫升的冷冻管(cryovial)内，即每个基因工程nk92细胞克隆有2个冷冻管。将盛有细胞的冷冻管放入装了酒精的mr.frosty冷冻盒内，再放入-80c的低温冻箱内过夜，冷冻细胞。第二天，将冷冻的细胞放入液氮冷藏罐内长期保藏。总计冷冻保藏了23个基因工程nk92的克隆细胞。
3，基因工程nk92细胞克隆的检测
导入外源基因的结构，拷贝数量和稳定性是基因工程nk细胞的一个十分重要的质量指标。在确立基因工程nk细胞克隆后，采用常规的分子生物学方法分析和研究在确立基因工程nk细胞克隆的外源基因结构。提取细胞的基因组dna。按照pcdna3.1(+)-il-2-t2a-hsv-tk质粒的dna序列设计pcr引物，用qpcr方法检测和确定il-2和hsv-tk基因在细胞内的拷贝数。用限制性内切酶图谱分析来确认导入外源基因的完整性。为了证实基因工程nk细胞外源基因的稳定性，培养细胞并连续传代30到40代。再用以上所述的分子生物学分析方法来检测和确定il-2和hsv-tk基因的完整性和在细胞内的拷贝数，以确认导入外源基因的稳定性。
从每个t-25细胞培养瓶中收集扩增的细胞。将细胞培养液加入到离心管内，在1500rpm，4c，下离心5-7分钟。去上清液，向离心管底部的细胞，加入冰冷的pbs缓冲液，来清洗细胞。再次在1500rpm，4c，下离心5-7分钟。去上清液，向离心管底部的细胞，加入冰冷的ripa(放射免疫沉淀分析缓冲液)细胞裂解液。在4c下，搅拌30分钟。然后在16000g,4c，下离心20分钟。收集上清液，放在冰上，用常规的蛋白浓度检测方法测定蛋白的浓度。为蛋白表达检测备用。
●il-2蛋白的表达检测
用常规的凝胶电泳方法，分离蛋白质。将分离的蛋白质转移到westernblot的膜上。用抗人il-2多克隆抗体(thermoscientific,cat#710146)来检测il-2的表达。基因工程nk92克隆细胞的il-2的表达水平请参阅图1。所有的基因工程nk92克隆细胞都在不同水平上表达了il-2蛋白。这和克隆细胞能在不含il-2的培养液内生长的现象是相符的。相对来讲，克隆4，7，和11有着较高的il-2表达量。
●hsv-tk蛋白的表达检
用常规的凝胶电泳方法，分离蛋白质。将分离的蛋白质转移到westernblot的膜上。用抗hsv-tk单克隆抗体(thermoscientific,cat#ma1-21542)来检测tk的表达。基因工程nk92克隆细胞的tk的表达水平请参阅图2。所有的基因工程nk92克隆细胞都在不同水平上表达了tk蛋白。相对来讲，克隆7，13,和23有着较高的tk表达量。
●tk敏感性检测
根据基因工程nk92克隆细胞的il-2和tk的表达水平，选择了细胞克隆7，进行了进一步的tk敏感性检测。采用atccnk-92细胞作为对照。将克隆7和atccnk-92细胞接种到相应的12空板内，每空加入1ml，细胞浓度1x105细胞/ml，一个12空板用于克隆7细胞，另外一个12空板用于atccnk-92细胞。atccnk-92细胞的培养液内加入了150单位/毫升的重组白细胞介素-2。在培养了24小时后，向培养的细胞内，分别加入0,5,10,50,75,和100μm(终浓度)的更昔洛韦(ganciclovir,gcv,sigma,catalog#g2536)。每个gcv浓度有两个空。继续培养96个小时。取样，用台盼蓝(trypanblue)染色检测细胞活性。基因工程nk92克隆细胞的tk敏感性检测结果请参阅图3。
克隆7细胞对gcv有着明显的敏感性，在高于10μm的gcv条件下，绝大多数细胞在96小时后就已死亡。证实了基因转入的tk基因的活性。相对而言，不含有tk基因的atccnk-92细胞对gcv没有表现出明显的敏感性。
●il-2和hsv-tk基因在细胞克隆内的拷贝数
从基因工程nk92克隆7细胞中提取基因组dna。用定量pcr方法检测和确定il-2和hsv-tk自杀基因拷贝数。用rnasep基因作为定量pcr基因拷贝数计算的标准。il-2基因定量pcr检测方法
左引物：tgcaactcctgtcttgcatt
右引物：gccttcttgggcatgtaaaa
探物：gaatcccaaactcaccagga
tk基因定量pcr检测方法
左引物：gccttgaccagggtgagata
右引物：atgctgcccataaggtatcg
探物：atgacaagcgcccagataac
pcr循环方法
变性/激活：95℃,5分钟，一次
变性：95℃,15秒
退火/延伸:60℃，1分钟
循环40次
表1il-2和hsv-tk基因在细胞克隆内的拷贝数
每个基因工程nk92克隆7细胞内有约对等的1个拷贝il-2和hsv-tk基因。克隆细胞起名为nk-sbn细胞。
4、nk-sbn的体外抗癌效应
在不同nk-sbn细胞和肿瘤细胞的比例条件下，比如50:1,20:1,10:1,5:1和1:1，共同混合培养nk-sbn细胞和不同种肿瘤细胞，比如hl-60,k562和jurkat细胞，采用europium细胞毒性检测法(delfia,perkinelmer)测定nk-sbn细胞对肿瘤细胞的裂解力，以证实nk-sbn细胞的抗肿瘤细胞效应。在试验中采用il-2激活的健康者的外周血单核细胞(pbmc)作为对照，用洗涤剂处理癌细胞(100％的癌细胞裂解)，校准europium细胞毒性检测法。
用rpmi培养液培养肿瘤细胞(hl60,raji,k562和jurkat细胞)。离心细胞，并用pbs清洗细胞。用delfiabatda试剂标签细胞，在37℃下培养30分钟。再用pbs清洗标签后的细胞，用rpmi培养液稀释到1x105/ml。放5000个细胞在96空板的空内(50微升)。取在对数生长期的nk-sbn细胞，离心细胞，并用pbs清洗细胞。将清洗过的细胞悬浮在培养液，浓度1e6/毫升。向含有肿瘤细胞的96空板内加入不同比例的nk-sbn细胞(比如50:1,20:1,10:1,5:1和1:1)。总体积100微升/空。在200g下离心96空板4分钟，以保证nk-sbn细胞和肿瘤细胞有足够的接触。将96空板放在37℃/5％co2细胞培养箱内培养2个小时。用多道移液器混合每个空的液体5-10次。在500g下离心96空板5分钟。从每个空内取出20微升，放入一个新的用于荧光检测的96空板内。向每个空内加入200微升的delfiaeuropium检测液。将96空板用铝膜包裹，放在轨道摇床上摇15分钟。向96空板内两个空的空内加入100微升的europium标准液。用荧光酶标仪(synergy2,biotek)在不同的时间间隙下测量荧光强度。测量设置条件为，
激发波长：330nm
发出波长：615nm
时间滞后：400μs
测量间隙：1000μs
测量高度：365毫米
nk-sbn细胞癌细胞杀伤率(％)＝nk-sbn细胞处理过的癌细胞荧光强度/洗涤剂处理过癌细胞荧光强度。
nk-sbn细胞的体外抗癌细胞效应请参阅图4。nk-sbn基因工程nk细胞对多种肿瘤细胞有着明显的杀伤裂解力。相对而言，正常的人pbmc对癌细胞则没有显示出杀伤裂解力。
5、nk-sbn的动物体内抗癌效应
在验证了体外抗肿瘤细胞结果的基础上，进一步验证基因工程nk细胞在动物体内的抗肿瘤效应。由于基因工程nk细胞是人细胞，动物体内试验要用严重联合免疫缺陷(scid)小鼠。首先通过腹腔在严重联合免疫缺陷(scid)小鼠身上打入5x106人白血病细胞，ta27，五天后，再通过腹腔注射2x107nk-sbn细胞，每隔一天注射一次，总共5次。对照组小鼠接受生理盐水注射。观察小鼠的健康状况，肿瘤发生期和生存期。基因工程nk细胞治疗应该表现出明显的抗肿瘤效果，延长小鼠的生存期。
采用重症联合免疫缺陷(scid)小鼠来做nk-sbn细胞体内抗癌效应试验。首先在小鼠腹腔接种培养好的人白血病细胞(细胞系ta27)，用rpmi+10％胎牛血清培养液培养ta27。收集对数生长期的细胞用于动物实验。四天后接受nk-sbn细胞治疗。总共用30个小鼠。分3组，每组10个小鼠。
第1组：第一天每个小鼠腹腔内注射5x106ta27细胞。注射前将ta27细胞悬浮于pbs缓冲液内。本组小鼠不接受nk-sbn细胞治疗(阴性对照组)，接受的是生理盐水注射，每隔一天注射一次，总共5次。每天观察小鼠的健康状况和体重。
第2组：第一天每个小鼠腹腔内注射5x106ta27细胞。注射前将ta27细胞悬浮于pbs缓冲液内。在第五天，每个小鼠腹腔内注射2x107nk-sbn细胞的治疗。每隔一天注射一次，总共5次。每天观察小鼠的健康状况和体重。
第3组：本组小鼠不接受人白血病细胞的注射。
在第五天，每个小鼠腹腔内注射2x107nk-sbn的细胞(阳性对照组)。每隔一天注射一次，总共5次，每天观察小鼠的健康状况和体重。nk-sbn细胞在动物体内的抗癌效应请参阅图5。基因工程nk-sbn细胞治疗达到了明显的抗肿瘤效果，有效的延长了小鼠的生存期。
6、nk-sbn细胞的安全性
采用1:1共同混合培养nk-sbn细胞和激活的健康者的外周血单核细胞(pbmc)4天，然后将pbmc细胞接种在甲基纤维素培养液内培养，数计红血球细胞集落数，粒细胞和巨噬细胞集落数和其他细胞集落数，用没有经过和nk-sbn细胞共同培养的外周血单核细胞(pbmc)作为对照。实验采用了3个健康者的外周血单核细胞。nk-sbn细胞和健康者外周血单核细胞(pbmc)的共同培养结果请参阅图6。结果显示nk-sbn细胞对健康者外周血单核细胞(pbmc)的生长没有不良影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>赛诺（深圳）生物医药研究有限公司
<120>治疗肿瘤的基因工程自然杀伤细胞产品
<160>7
<210>1
<211>462
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
1atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacctacttcaagttctac
81aaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatc
161ccaaactcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaa
241gaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcag
321caatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaacca
401ttgtagaatttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaacttga
<210>2
<211>1191
<212>dna
<213>人工合成
<400>2
1atggcttcgtaccccggccatcagcacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaaccgacgtac
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161tagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctac
241gtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcct
321tgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccg
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1121aggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaa
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