一种用于烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:15457615发布日期:2018-09-15 01:34
本发明属于植物病毒检测
技术领域
,具体涉及一种用于烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。
背景技术
:烟草脉斑病主要由马铃薯Y病毒PotatovirusY(PVY)侵染引起,常与黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)、烟草蚀纹病毒Tobaccoetchvirus(TEV)、烟草脉斑驳病毒Tobaccoveinmottlevirus(TVMV)、烟草坏死病毒Tobacconecrosisvirus(TNV)等病毒中的1个或多个复合侵染烟株。烟草脉斑病样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。由于烟草脉斑病样品中存在多种病毒复合侵染的现象,采用传统的血清学、PCR等方法对症状表现明显的烟草病毒病原进行鉴定不能完整地反映样品中的病毒,故亟需一种用于烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。技术实现要素:有鉴于此,本发明的目的在于提供一种用于烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒与检测方法。技术方案:本发明所述的一种用于烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒,包括两条特异性引物:SPLVGV-1:5’-TGTAACGAAAGGGACTAGTGCAAAGG-3’;SPLVGV-2:5’-CCGCTATGAGTAAGTCCTGCACAGC-3’。进一步的,所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。进一步的,所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明中还提供一种烟草脉斑病病毒的检测方法,其包括以下步骤:(1)提取待测样品总RNA;(2)设计并合成引物;(3)RT-PCRa.反转录合成cDNA,以烟草总RNA为模板,以SPLVGV-2引物,通过反转录酶合成cDNAb.PCR扩增,以cDNA为模板,以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物,进行PCR反应;(4)电泳检测吸取2.5μLRT-PCR产物进行0.8-1.5%的琼脂糖凝胶电泳,经核糖染色Goldview,通过凝胶成像仪观察,在感染该烟草脉斑病病毒的烟草样品中有895bp的核酸条带。进一步的,所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。进一步的,所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性1min;54℃退火1min;72℃延伸1min,共进行35个循环,72℃延伸7min,4℃保存。有益效果:本发明提供了一种在检测烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属鉴别诊断的试剂盒与检测方法,利用RT-PCR方法检测烟草脉斑病中马铃薯Y病毒属,克服了分离烟草病毒核酸的繁琐步骤,节省时间,大大提高了检测的可操作性、灵活性和可重复性,为烟草脉斑病病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明作进一步的详细说明,该实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明保护范围的限定。实施例(1)引物设计与合成根据烟草小RNA高通量测序分析结果,设计并合成该烟草脉斑病中烟草花叶病毒的特异性引物:SPLVGV-1(TGTAACGAAAGGGACTAGTGCAAAGG)和SPLVGV-2(CCGCTATGAGTAAGTCCTGCACAGC);(2)总RNA提取多肽多酚植物组织裂解法(3)RT-PCRa.反转录合成cDNA以烟草总RNA为模板,以SPLVGV-2引物,通过反转录酶为MLV,合成cDNA,反转录体系为:轻弹管壁混匀,稍离心后,42℃保温60min,然后置冰上待用;b.PCR扩增cDNA2μL2×TaqMix10μLSPLVGV-1(10μmol)2μLSPLVGV-2(10μmol)2μLddH2O至10μLPCR程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,54℃退火1min,72℃延伸1min,共进行35个循环,72℃延伸7min,4℃保存;(4)电泳检测吸取2.5μLRT-PCR产物进行0.8-1.5%的琼脂糖凝胶电泳,经核糖染色Goldview,通过凝胶成像仪观察,有895bp的核酸条带,为受烟草脉斑病病毒侵染的的烟草样品,无条带为健康植株。以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。当前第1页1 2 3 
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