本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用。
背景技术：
：棉花作为重要的经济作物，棉纤维与人们的生活息息相关。棉纺织品一直以来被列为中国进口商品中的重要项目，目前我国每年进口棉花高达上百万吨，来自世界40多个国家和地区，总货值达上百亿美元。大量进口的棉花虽然缓解了国内供需矛盾，但对国产棉原有市场份额造成冲击，同时进口棉花出现了以次充好、弄虚作假等一系列质量不合格等问题，因此迫切需要一种简便方法来进行棉花品种纯度检测以及产地溯源。目前有多种方法来鉴定棉花品种纯度和真实性，如：小区种植鉴定法、卡那霉素法和DNA分子标记法(周大云等)。DNA分子标记法具有检测速度快、成本低、结果可靠等特点备受人们青睐。简单序列重复SSR(SimpleSequenceRepeats)又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记，实验操作中对DNA的数量和质量要求不高，即使部分样品有所降解也可进行分析；实验程序简单，操作简便、快速，用时短，不需要使用同位素；扩增产物可靠稳定，重复性好；被认为是目前构建指纹图谱的首选标记，目前已有多种植物以SSR分子标记方法构建了相应的指纹图谱，为品种纯度和真伪性鉴定提供理论依据，也为分子育种过程中亲本的选育提供参考。常规用于棉花分子标记的组织多为种子、叶、茎等组织，很少采用棉花纤维作为供试材料，由于成熟棉纤维含有超过90％的纤维素，且DNA多发生降解，这些都限制着提取的棉纤维DNA的数量和品质。因此开发一种快速提取棉花纤维DNA的方法，且提取的DNA能满足于常规PCR和SSR-PCR扩增，对研究棉花重要农艺性状和棉花品种纯度以及产地溯源具有重要意义。技术实现要素：本发明目的在于提供一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其在常规PCR扩增和SSR-PCR扩增中的应用，旨在开发以棉花纤维为介质来进行品种纯度鉴定、产地溯源等方面的应用。本发明具体通过以下技术方案来实现：一种快速提取棉花纤维DNA的方法，包括以下步骤：1)将棉花纤维充分剪碎后用液氮研磨；2)加入细胞裂解液充分混合，水浴30分钟；3)加入等体积抽提液离心后，取上清加入-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟；4)离心弃掉上清液；5)加入70％乙醇水溶液，离心弃掉上清液，重复2～3次；6)加入无水乙醇离心，弃掉废液，室温晾置；7)加入无菌水，4℃保存。进一步，步骤(2)中所述的细胞裂解液为：Tris100mmol/L、EDTA10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-3020g/L、Tween2020g/L、NaCl1mol/L、β-巯基乙醇2％(v/v)，调pH至8.0。进一步，步骤(2)中水浴温度保持在65℃。进一步，步骤(3)所述的抽提液为氯仿和异戊醇按照体积比为24:1配置得到。进一步，步骤(3)中预冷异丙醇的添加量为0.6倍体积。进一步，上述所述的离心条件均为：12000rpm，4℃。此外，本发明还提供了上述方法在棉花品种分子标记中的应用。本发明的有益效果为：利用本发明方法可以提取不同发育时期的棉花纤维DNA以及不同年份的皮棉DNA，并以所获得的纤维DNA作为模板，对特定基因进行了常规PCR扩增；以棉花特定SSR引物对棉花纤维DNA进行PCR扩增，建立一种以棉花纤维为介质对棉花品种真实性及品种产地溯源的鉴定体系。该方法可以快速提取棉纤维DNA，利用棉纤维DNA分子标记精准的对棉花品种和原产地进行溯源，对保障我国棉花产业安全和应对国际贸易壁垒具有重要的意义。附图说明图1是不同发育时期的棉花纤维DNA在琼脂糖凝胶上的检测结；其中0DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA、30DPA、40DPA分别为开花后不同天数的棉花纤维，0DPA为开花当天胚珠，做阳性对照，Ginnedcotton为皮棉；图2是不同发育时期的棉纤维DNA特定基因PCR扩增结果图；其中GhHis3、GhUBI7、GhEF1分别代表棉花三个不同基因，Negative为阴性对照；图3是不同年份皮棉DNA特定基因PCR扩增结果图；其中2017、2016、2014、2010、2009代表不同年份的皮棉，Negative：阴性对照；图4是棉纤维DNA的SSR引物扩增结果图；其中CS62、NAU1043、NAU1071、NAU1085、NAU1102、NAU1103、NAU1186、NAU1196、NAU1233、NAU1255、NAU1369、NAU2026和NAU2173分别为棉花SSR核心引物，1、2、3分别为棉花品种鲁1127、石抗126和瑞杂816。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。生物材料：本发明所涉及的棉花纤维来源于陆地棉TM-1，种子由中国农业科学院棉花研究所提供，材料种植于中国农业科学院棉花研究所露天实验基地，所涉及的皮棉材料由中国农业科学院棉花研究所保存；实验试剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Tris、EDTA、PVP-30、吐温20(Tween20)、NaCl、β-巯基乙醇均购于北京索莱宝生物科技有限公司，Taq酶、电泳MarkerII、Marker2K购于北京全式金生物科技有限公司；引物合成：本发明所涉及的引物均有上海生工生物有限公司合成；裂解液配方：Tris100mmol/L、EDTA10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-3020g/L、Tween2020g/L、NaCl1mol/L、β-巯基乙醇2％(v/v)，调pH至8.0。实施例1棉花纤维DNA的提取棉花纤维富含纤维素、半纤维素、果胶等物质，细胞壁厚，加大了裂解纤维细胞壁的难度。本发明选取棉花纤维和不同年份的皮棉作为研究材料，采用全新裂解液配方取棉纤维DNA，具体过程如下：1)取100-200mg棉花纤维，充分剪碎并液氮研磨。2)加入1.5mL细胞裂解液，充分混匀，65℃水浴30分钟，水浴过程中颠倒离心管数次。3)加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1,V/V)抽提液，缓慢颠倒多次，12000rpm，4℃，离心10分钟。4)取上清转入新的离心管中，加入0.6倍体积-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟。5)12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉上清液。6)向离心管中加入600μl70％乙醇水溶液，12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉上清液。7)重复步骤6。8)加入无水乙醇，12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉废液，室温晾置几分钟。9)加入40μl无菌水，4℃保存。实施例2不同发育时期的棉花纤维DNA凝胶电泳检测及常规PCR扩增选取棉花开花后不同发育时期(0DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA、30DPA、40DPA、Ginnedcotton)的棉纤维作为供试样品，采用实施例1提取法提取DNA，将所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明0DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA时期的纤维DNA均可呈现DNA条带，而30DPA、40DPA、Ginnedcotton纤维DNA未呈现DNA条带，如图1所示。用NanoDrop2000超微量分光光度计检测30DPA、40DPA、Ginnedcotton时期的纤维DNA浓度发现以这些时期为材料所提的DNA浓度很低(5ng/μl左右)。为了验证以上述方法提取的棉纤维DNA能否用于常规PCR中，选取棉花GhHis3、GhUBI7、GhEF1基因引物对所获得DNA进行常规PCR扩增，引物序列如表1，反应体系和反应程序如下：表1常规PCR引物名称及序列引物对名称正向引物序列(5’to3’)反向引物序列(5’to3’)GhHis3ATGGCCCGTACCAAGCAAACTTAAGCACGCTCTCCCCTGAGhUBQ7ATGCAGATCTTCGTCAAAACCCTCAATCCCCACCAGCCTTCTGhEF1TGGTATCACCATTGATATTGCCTATGACCTGAGAAGTGAAGTTTGC反应体系：10×Buffer(含MgCl2)2μl，10mMdNTPs0.4μl，2.5U/μlTaq酶0.2μl，10μM正向引物0.25μl，10μM反向引物0.25μl，DNA模板1μl，15.9μlddH2O。反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，40个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，如图2所示。结果表明不同时期的纤维DNA均可以扩增出清晰的目的基因DNA条带，说明了利用这种DNA提取法提取的不同时期的纤维DNA能满足常规的PCR，完全适用于后续系列分子生物学的研究。实施例3不同年份皮棉DNA的PCR扩增本实施例中主要为了验证利用这种DNA提取方法能否对不同年份的皮棉进行DNA提取，选取了不同年份(2017、2016、2014、2010、2009年)采摘的成熟棉纤维作为供试样品，以实施例1中所描述的DNA提取法提取基因组DNA，以所获得的DNA作为模板，用棉花GhHis3、GhUBI7、GhEF1基因引物对所获得DNA进行PCR扩增，引物序列如表1，反应体系和反应程序如下：反应体系：10×Buffer(含MgCl2)2μl，10mMdNTPs0.4μl，2.5U/μlTaq酶0.2μl，10μM正向引物0.25μl，10μM反向引物0.25μl，DNA模板1μl，15.9μlddH2O。反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，40个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，如图3所示。结果表明不同基因均扩增出清晰的条带，也说明了利用实施例1中的方法提取到了不同年份皮棉DNA的质量可满足于常规PCR扩增，对后续系列生物学实验具有重大意义。实施例4棉纤维DNA的SSR-PCR扩增SSR-PCR实验操作中对DNA的数量和质量要求不高，即使部分样品有所降解也可进行分析。本实施例中主要为了验证通过实施例1中所描述的方法提取的棉花皮棉(鲁1127、石抗126和瑞杂816)纤维DNA能否用于SSR-PCR扩增，选取了13对棉花SSR核心引物进行SSR-PCR扩增，引物分别为CS62、NAU1043、NAU1071、NAU1085、NAU1102、NAU1103、NAU1186、NAU1196、NAU1233、NAU1255、NAU1369、NAU2026和NAU2173，序列如表2，反应体系和反应程序如下：表2SSR核心引物名称及序列引物对名称正向引物序列(5’to3’)反向引物序列(5’to3’)CS62GATGGCTACCTCCCTTTGTACGTAAGGAAGCCTAGCAAAANAU1043GTATCCGCCCACAAATAAAGCATCGTGAGAGAAAGTGAANAU1071ACCAACAATGGTGACCTCTTCCCTCCATAACCAAAAGTTGNAU1085AGTCGCCCCTTCTCTAATTTTGTAAACCGAACTCGTTGTGNAU1102ATCTCTCTGTCTCCCCCTTCGCATATCTGGCGGGTATAATNAU1103GGAGCCAGAAGTTGAGAAAATTCGGCTTCTGCTTTTACTTNAU1186AATGGTCCTGCTCCAGATTAATCGTCGTCGTCGAATTATNAU1196ATCTGTTTCCGTACCCTCAAATGGTTGCCCAAACAATACTNAU1233TTCGGGAAAGTTAGAGGAGATCCTCAGAGCTCGGAATAGTNAU1255CATGCAAATCCATGCTAGAGGGTTTCTTTGGTGGTGAAACNAU1369TGGCAGAGATGAATGTAAGCGGTAACGGATGGAAAATCACNAU2026GAATCTCGAAAACCCCATCTATTTGGAAGCGAAGTACCAGNAU2173GCCAAATAGGTCACACACAAAGCGAGAAGGAGACAGAAAA反应体系：10×Buffer(含MgCl2)2μl，10mMdNTPs0.4μl，2.5U/μlTaq酶0.2μl，10μM正向引物0.25μl，10μM反向引物0.25μl，DNA模板1μl，15.9μlddH2O。反应程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，40个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。将PCR产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，显影拍照，如图4所示。结果表明利用该提取法提取的皮棉纤维DNA完全满足于棉花SSR分子标记，且扩增出的条带清晰可辨，为棉纤维作为介质的棉花品种纯度，产地溯源提供了技术支持。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表<110>中国农业科学院棉花研究所<120>一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用<141>2018-04-28<160>32<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1atggcccgtaccaagcaaac20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2ttaagcacgctctcccctga20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3atgcagatcttcgtcaaaaccc22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4tcaatccccaccagccttct20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5tggtatcaccattgatattgcct23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6atgacctgagaagtgaagtttgc23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>7gatggctacctccctttgta20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>8cgtaaggaagcctagcaaaa20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>9gtatccgcccacaaataaa19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>10gcatcgtgagagaaagtgaa20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>11accaacaatggtgacctctt20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>12ccctccataaccaaaagttg20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>13agtcgccccttctctaattt20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>14tgtaaaccgaactcgttgtg20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>15atctctctgtctcccccttc20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>16gcatatctggcgggtataat20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>17ggagccagaagttgagaaaa20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>18ttcggcttctgcttttactt20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>19aatggtcctgctccagatt19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>20aatcgtcgtcgtcgaattat20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>21atctgtttccgtaccctcaa20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>22atggttgcccaaacaatact20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>23ttcgggaaagttagaggaga20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>24tcctcagagctcggaatagt20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>25catgcaaatccatgctagag20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>26ggtttctttggtggtgaaac20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>27tggcagagatgaatgtaagc20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>28ggtaacggatggaaaatcac20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>29gaatctcgaaaaccccatct20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>30atttggaagcgaagtaccag20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>31gccaaataggtcacacacaa20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>32agcgagaaggagacagaaaa20当前第1页1 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