一种用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒的制作方法

文档序号:15457558发布日期:2018-09-15 01:33

本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒。



背景技术:

口腔鳞癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤之一,晚期口腔鳞癌5年生存率低,而且根治性手术造成的颜面创伤及吞咽、言语障碍严重影响患者的生存质量和心理健康。早期确诊及适当的医疗措施是提高口腔鳞癌患者生存率的唯一方式。

目前人体组织病理学仍然依赖于病理医生判断,不同病理医生评估具有主观性,重复性较差。随着精准医学的发展,以分子分型诊断的技术越来越受到重视。目前最为成熟的分子分型诊断技术是使用即时聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,其中Polymerase Chain Reaction以下简称PCR)技术检测某些基因mRNA的表达,来作为生物分子标志物(基因或基因组合),主要是利用其高通量的特征,既保证了检测过程的可靠,也提高了检测结果的准确、可信,且这类预测基因mRNA在人体其他部位恶性肿瘤中多有报道,但在口腔鳞癌中未见报道。

基因mRNA作为生物分子标志物既有其独特的优势,但也存在一些技术问题,样本量越大,独立检测人群越多,基因mRNA预测准确性越高,越接近人群整体的特征,但大样本的收集与处理存在一定难度,原因是对入组样本有一定要求,符合要求样本不易收集,样本保存记录工作量大。

目前主流筛选候选标志基因mRNA分子的手段一般是高通量方法初筛,然后再用即时聚合酶链式反应进行验证,方法稳定,技术上比较成熟,但也容易出现一些假阳性结果;利用探针法检测候选基因mRNA分子,在提升检测特异性的同时,也会降低实验灵敏度,一定程度上会存在漏诊率,且不同批次样本与实验试剂之间也会存在一些差异,而影响结果。人体是一个复杂的体系,单一基因mRNA预测存在一定的误诊及漏诊率,通过高效的数学建模的方法找寻肿瘤特异性的基因mRNA也是问题关键,只有确定出肿瘤来源的基因mRNA,并对其进行分析才能更好的诊断和预测。

因此,为提高口腔鳞癌早期诊断的客观性、准确性和特异性,本领域的技术人员致力于寻找用于口腔鳞癌早期诊断的生物分子标志物(基因或基因组合),开发出一种能用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒。



技术实现要素:

有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是确定用于口腔鳞癌早期诊断的生物分子标志物(基因或基因组合),开发出一种能用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒。

为实现上述目的,本发明提供了一种能用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒,包括11种基因:MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NUM、IL1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1的mRNA序列的上、下游引物序列。

进一步地,还包括作为内参照的管家基因的引物。

进一步地,所述管家基因为β-actin。

进一步地,还包括:总RNA抽提试剂、和/或PCR反转录试剂、和/或PCR定量试剂。

进一步地,所述总RNA抽提试剂包括TRIzol试剂。

本发明还提供了一种筛选用于口腔鳞癌早期诊断的基因或基因组合方法,包括以下步骤:

步骤一、筛选出口腔鳞癌相关差异表达基因,合成所述口腔鳞癌相关差异表达基因的mRNA序列的引物并制成检测试剂盒,所述口腔鳞癌相关差异表达基因包括:MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NUM、IL1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1;

步骤二、采集口腔鳞癌患者的肿瘤组织、正常组织成立候选组,利用步骤一制成的检测试剂盒定量检测候选组中所述口腔鳞癌相关差异表达基因的表达水平,其中检验过程中基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃;

步骤三、根据所述口腔鳞癌相关差异表达基因的表达水平,采用OPLS-DA建模方法和ROC曲线分析,确定口腔鳞癌早期诊断的基因。

进一步地,还以下步骤:

步骤四、另外采集口腔鳞癌患者的肿瘤组织、正常组织成立独立验证组,利用步骤一制成的检测试剂盒定量检测验证组中所述口腔鳞癌早期诊断基因的表达水平,其中检验过程中基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃;

步骤五、根据所述口腔鳞癌早期诊断基因的表达水平,采用OPLS-DA模型验证和ROC曲线分析,验证所述口腔鳞癌早期诊断基因在口腔鳞癌早期诊断中的准确性和稳定性。

进一步地,口腔鳞癌患者的数目大于或等于30例。

进一步地,在步骤一中,筛选所述口腔鳞癌相关差异表达基因的方法包括:对原发性口腔鳞癌肿瘤组织和配对的自体正常组织进行基因表达谱芯片检测,通过统计学方法筛选获得口腔鳞癌相关差异表达基因;和/或从与口腔鳞癌相关的基因表达谱芯片研究文献中筛选获得口腔鳞癌相关差异表达基因。

本发明还提供了MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NUM、IL1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1基因组合在制备用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒中的应用。

与现有技术相比:本发明是首次提出的用于口腔鳞癌早期诊断的检测试剂盒,能客观、及早、准确、灵敏地确诊口腔鳞癌,从而有助于提高口腔鳞癌患者生存率。

以下将结合附图对本发明的构思、具体实施及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本具体实施方式中筛选组的78个口腔鳞癌相关差异表达基因的S-polt图;

图2是本具体实施方式中筛选组的MMP1+PLAU+SPP1+KRT15+NUM+IL1RN+HOPX+TGM3+KRT13+MAL+EMP1基因的Heatmap图;

图3是本具体实施方式中筛选组的正常癌旁组织和口腔鳞癌组织的OPLS-DA图;

图4是本具体实施方式中筛选组的MMP1+PLAU+SPP1+KRT15+NUM+IL1RN+HOPX+TGM3+KRT13+MAL+EMP1基因组合的ROC曲线;

图5是本具体实施方式中验证组的MMP1+PLAU+SPP1+KRT15+NUM+IL1RN+HOPX+TGM3+KRT13+MAL+EMP1基因的Heatmap图;

图6是本具体实施方式中验证组的正常癌旁组织和口腔鳞癌组织的PCA-plot图;

图7是本具体实施方式中验证组的MMP1+PLAU+SPP1+KRT15+NUM+IL1RN+HOPX+TGM3+KRT13+MAL+EMP1基因组合的ROC曲线。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本实施例中试剂盒,包括总RNA(核糖核酸)抽提试剂(厂家:赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:15596018)、PCR反转录试剂(厂家:赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:4374967)、PCR定量试剂(厂家:赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:11736059)。试剂盒还包括,下述78个口腔鳞癌相关差异表达基因mRNA序列的上、下游引物序列,选择β-actin管家基因作为内参照,所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

对采集到的200mg人新鲜组织采用TRIzol试剂(厂家:Invitrogen公司)进行总RNA抽提,将抽提得到的总RNA利用带有核糖核酸酶抑制剂的High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(译名:高容量cDNA逆转录试剂盒,厂家:赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:4374967)进行反转录。

对Real-time PCR条件进行优化:要求所有基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃。这一步是本试剂盒的关键步骤之一,这一步利用退火温度的一致性,大大提高了试剂盒检测过程中的特异性。

将反转录得到的样本,进行探针法定量PCR反应,得到口腔鳞癌相关基因的相对表达值,进行统计分析。

本实施例中试剂盒的具体制备过程还包括:

(1)筛选口腔鳞癌相关差异表达基因

通过对22例原发性口腔鳞癌组织和配对的自体正常组织进行Affymetrix HU95基因表达谱芯片(芯片生产者为美国Affymetrix公司)检测和7种统计学方法(T-test,Wilcoxon rank-sum,paired t-test,Significant Analysis of Microaary,Predict Parameter Value function of Gene Spring software,Mininum Distance to Modal Ranking,WEighted Punishment on Overlap)筛选获得了口腔鳞癌差异基因表达谱,结合临床肿瘤标本在基因转录和蛋白水平的验证确定了38个口腔鳞癌相关差异表达基因。

再采用“微阵列分析(microarray analysis)”和“头颈鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma)”或“口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma)”为主题词在美国国立生物信息中心网站上的公众数据库(Pubmed)中检索查阅了2000-2018年期间报道的与口腔鳞癌相关的基因表达谱芯片研究文献42篇。与上述38个口腔鳞癌相关差异基因相对比并查找新的口腔鳞癌相关基因。查找文献中口腔鳞癌相关差异基因具体标准为:①4篇以上文献报道该基因是口腔鳞癌相关差异表达基因,且该基因在所有文献中升高或降低趋势一致;②表达谱芯片中,该基因的肿瘤相对于正常组织表达的差异倍数大于2倍和P<0.05。最终筛选到78个口腔鳞癌相关差异表达基因,其中上调基因45个,下调基因33个。这些基因分布于各种肿瘤相关信号通路,GO分类发现这些基因广泛参与各项重要生理功能调控,包括免疫反应、炎症反应、生长发育、周期调控、细胞骨架、应激反应、细胞凋亡、细胞增殖调控和细胞黏附等。

在NCBI数据库Genbank中找到这78个口腔鳞癌相关差异表达基因的mRNA序列,应用Primer 5.0软件设计这78个mRNA序列的上、下游引物序列,选择β-actin管家基因作为内参照,所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

(2)确定口腔鳞癌早期诊断的基因

成立候选组:收集120例口腔鳞癌患者的口腔鳞癌组织(N=120)及配对的自体正常癌旁组织(N=120),也可以是其他正常组织。在基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃情况下,通过qRT-PCR技术(即时定量PCR)检测候选组中上述78个口腔鳞癌相关差异表达基因的表达水平,并通过正交校正的偏最小二乘分析-判别分析(OPLS-DA)建模方法及受试者工作特征曲线分析(ROC曲线)确定口腔鳞癌早期诊断的基因谱型,具体建模方法如下:

模型建立:Xtr=TtrWT+TtroWoT Ytr=UtrCT

差异表达基因判定准则:表达水平与OPLS-DA的第一个分量的相关系数大于0.5并且对应的p值小于Bonferroni校正后的0.05。

图1、图2、图3是候选组的OPLS-DA建模结果图。

根据结果,其中MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NMU、1L1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1联合的准确率最好,ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.99361,见图4,因此选择MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NMU、1L1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1作为口腔鳞癌早期诊断的基因。

(3)验证口腔鳞癌早期诊断的基因

成立验证组:另外独立收集了37例口腔鳞癌患者的口腔鳞癌组织(N=37)及配对的正常癌旁组织(N=37)。在基因扩增的反应条件一致且退火温度均为60℃情况下,通过qRT-PCR技术检测筛选组中上述11个口腔鳞癌早期诊断的候选基因的表达水平。通过OPLS-DA模型验证及ROC曲线分析进一步评估这11个基因分子表达谱型在口腔鳞癌早期诊断中的准确性和稳定性。

模型验证

模型风险预测:To=Xtest Wo(WoTWo)-1 Po=XtrTtro(TtroTTtro)-1

Xtest=Xtest-ToPo Ttest=XtestW(WTW)-1

风险评分:riskscore=Ttest(TTtrTtr)-1TTtrUtrCT

风险评分>0诊断为口腔鳞癌,风险评分<0诊断为非口腔鳞癌

图5、图6是验证组的OPLS-DA验证结果图。

根据验证结果,确定了MMP1+PLAU+SPP1+KRT15+NUM+IL1RN+HOPX+TGM3+KRT13+MAL+EMP1联合在口腔鳞癌早期诊断中的准确性和稳定性,ROC曲线的AUC为0.9664,见图7,因此进一步确定MMP1、PLAU、SPP1、KRT15、NMU、1L1RN、HOPX、TGM3、KRT13、MAL、EMP1作为口腔鳞癌早期诊断基因。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

再多了解一些
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