一个用于法医学个体祖先信息推断的42个SNP位点的检测系统的制作方法

文档序号:15457578发布日期:2018-09-15 01:33
本发明属于法医学基因检测
技术领域
,具体涉及一种用于法医学个体祖先信息推断的42个SNP位点的检测系统。
背景技术
:单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是DNA序列多态性的一种类型,被认为是继短串联重复序列(ShortTandemRepeat,STR)后的第三代遗传标记,近些年来SNP在法医学实践上显示出强大的优越性。SNP广泛存在于人类基因组中,大约每1000bp存在一个SNP。与STR相比,SNP基因座的扩增片段可以更短,单个位点的扩增片段长度通常在200bp以下,更适合PCR扩增,分析降解检材的DNA能力更强。在法医学领域,除应用于亲缘鉴定和个体识别外,还可以应用于推断个体的祖先信息、个体表型特征识别等。随着国际化和经济全球化的不断发展,各国之间人员往来更加频繁,使得跨地区、跨国的犯罪数量日益上升。在法医学上,对于在案发现场或者大型灾难事故现场中获得的难以辨认面貌的高度腐败或者毁损的尸体,高度降解的生物检材以及遗留的人血液、精液,进一步挖掘犯罪现场DNA样本所蕴含的遗传信息,以及获取这些检材来源人的祖先信息,是法医遗传学领域极为重要的研究方向,有利于缩小侦查范围,为案件的侦破提供指向性的线索。始祖信息位点(AncestryInformativeMarkers,AIMs),是指在不同人群之间等位基因频率差异非常大的基因位点。STR、SNP、线粒体DNA(MitochondrialDNA,mtDNA)都是存在潜在应用价值的AIMs,但是由于STR和mtDNA的突变率较高,各群体之间等位基因差异较小等原因,STR和mtDNA并不能很好的作为AIMs适用于进行始祖信息的推断。SNP位点由于其稳定性好、分布范围广、各群体间等位基因频率差异较大等原因,成为始祖信息推断较好的工具。目前,常用的SNP检测技术是基于单碱基延伸原理和毛细管电泳的SNaPshot技术。然而,该技术一次最多检测30个左右的基因座,如果将几十个SNP位点放在一个反应体系中复合扩增,对引物设计、引物浓度和退火温度的调整以及反应体系的优化具有很高的要求,如果要检测更多的SNP基因座则需要多次反应,需要的检材量大,不利于微量物证的检测,限制了多个SNP位点在始祖推断中的应用。飞行时间质谱(MassArray)技术是结合多重PCR技术、MassARRAYiPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术进行分型检测,与其他分型方法相比,该系统具有检测快速、分型准确、灵敏度高、不需要荧光标记、易于大规模及高通量的操作等优势,可以在一个体系内同时检测更多的SNP位点,具有良好的应用前景。技术实现要素:本发明的一个目的是开发一种用于法医学个体祖先信息推断42个SNP位点的检测系统,该系统可同步扩增42个SNP位点:rs1012586、rs10496971、rs10506957、rs1205357、rs1211554、rs1510523、rs1800498、rs1876482、rs4466287、rs4756、rs4918664、rs590086、rs67302、rs7226659、rs723220、rs748144、rs7516782、rs7528721、rs7752055、rs7927633、rs8072587、rs8081883、rs8137373、rs931247、rs2056126、rs12142199、rs12419341、rs1366220、rs1399272、rs1453858、rs1475840、rs1557553、rs16891982、rs2080161、rs2267666、rs2289266、rs3176921、rs3827760、rs4749305、rs728404、rs741272和rs830599。在本发明的实施方案中,所述系统的PCR的扩增体系包含Water(HPLCgrade)、PCRBuffer、25mMMgCl2、25mMdNTPMix、PCR引物Mix和PCREnzyme。所述系统的SAP反应体系包含Water(HPLCgrade)、SAPBuffer和SAPEnzyme,所述系统的IPLEX反应体系包含Water(HPLCgrade)、iPLEXGOLDBuffer、iPLEXTerminationmix、iPLEX延伸引物混合物和iPLEXEnzyme。本发明所述检测系统可以检测各种人体组织的样本DNA,例如人血液、唾液、毛发、指甲、阴道分泌液或精斑等样本DNA。在检测DNA样本时,本发明试剂盒的具体扩增体系如下:反应体系浓度单孔体系各组分的体积(µl)Water(HPLCgrade)-1.8PCRBuffer10×0.5MgCl225mM0.4dNTPMix25µM0.1PCR引物MIX0.5µU1.0PCREnzyme5U/ml0.2DNA10ng/µl1.0总体积-5.0本发明的另一个目的是提供所述系统的检测方法,所述检测方法不仅能用于推断样本来源人的始祖信息,又能揭示不同群体的遗传结构,明晰不同群体间的群体遗传学关系;具体步骤如下:1.样本的准备:样本DNA的吸光度要求OD260/OD280在1.7-1.9,DNA浓度>10ng/µl。2.引物的稀释:将合成的引物干粉按照合成的顺序排列,12000rpm离心1分钟;添加1×TEbuffer至PCR引物浓度为100µM,延伸引物为500µM;涡旋振荡,离心,放置过夜至其溶解后配制引物Mix,备用。3.引物Mix的制备3.1PCR引物稀释浓度为100µM,配制终浓度为0.5μM的PCR引物Mix;3.2延伸引物Mix的制备;3.3PCR体系的制备。分别取1.8µlWater(HPLCgrade),1µl0.5µMPCR引物Mix,0.5µl10xPCRBuffer,0.4µl25mMMgCl2,0.1µl25mMdNTPMix,0.2µl5U/µlPCREnzyme至1.5m3l管配制PCRMix。加入1µlDNA,涡旋震荡和离心;3.4PCR反应程序:预变性95℃2min,然后95℃30sec、56℃30sec、72℃60sec共45个循环,72℃5min,最后4℃保存。4.SAP混液的配制4.1分别取1.53µl超纯水,0.17µlSAPBuffer,0.30µlSAPEnzyme(1.7U/µl)配制SAP混液(该体系为单孔);4.2每一个孔加入2µlSAP混液,完成后,用膜把板封好,涡旋震荡和离心;4.3将封好的板放上PCR仪进行以下程序:37℃40min,85℃5min,4℃保存。5.延伸反应5.1分别取0.619µl灭菌去离子水,0.2µliPLEXGOLDBuffer,0.2µliPLEXTerminationmix,0.94µliPLEX延伸引物混合物,0.041µliPLEXEnzyme(该体系为单孔)配制iPLEX延伸混液;5.2加入2µl上述iPLEX延伸混液并混合,涡旋震荡和离心;5.3根据以下程序进行热循环:step1:94℃30s;step2:95℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,重复40个循环;step3:72℃3min;step4:4℃长期保存。6.脱盐处理6.1洁净树脂(Resin)铺平在384/6mgdimpleplate上,风干最少10分钟;6.26.2在样本板的每一个有样本的孔里加入16µl水。完成后,用膜把板封好,涡旋震荡15min,然后2000rpm离心5min;6.3加入6mg洁净树脂(Resin):轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimpleplate上,然后将dimpleplate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动),让树脂掉到孔里。用膜把板封好,放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。以3200g将板离心5分钟;7.启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。8.将点样后的SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析,检测结果使用TYPER4.0软件自动解读质谱检测的分子量峰,转化显示为SNP位点所对应的分子量质谱峰图。本发明提供一种用于法医学个体祖先信息推断的42个SNP位点的检测系统,包括扩增体系、测序的读长的统计以及测序结果分析,最终提供每个SNP位点的分型结果。本发明利用了新一代的MassARRAY测序技术对祖先信息SNP位点进行分型检测,相比于传统的毛细管电泳,此技术能够提供更深的覆盖,另外的一个优点是可以将不同的引物进行混合扩增,一次性得到多个SNP的扩增产物,然后进行分型检测。附图说明图1:实施例1检测一个DNA样本rs67302位点的结果。图2:实施例1检测一个well中rs67302位点的结果。图3:实施例1检测一百份不同样本DNA的rs67302位点的分析检测结果。具体实施方式下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是,以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明,并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1在检测DNA样本的42个SNP位点时,本发明体系的具体扩增体系如下:反应体系浓度单孔体系各组分的体积(µl)Water(HPLCgrade)-1.8PCRBuffer10×0.5MgCl225mM0.4dNTPMix25µM0.1PCR引物MIX0.5µU1.0PCREnzyme5U/ml0.2DNA10ng/µl1.0总体积-5.0本发明的另一个目的是提供所述系统的检测方法,所述检测方法不仅能用于推断样本来源人的祖先信息,又能揭示不同群体的遗传结构,推断不同群体间的群体遗传学关系;具体步骤如下:1.样本的准备:取人全血样本,采用磁珠法提取全血样本的DNA并进行浓度测定,提取的DNA吸光度要求OD260/OD280在1.7-1.9之间,DNA浓度>10ng/µl。2.引物的稀释:将合成的引物干粉按照合成的顺序排列,12000rpm离心1分钟;添加1×TEbuffer至PCR引物浓度为100µM,延伸引物为500µM;涡旋振荡,离心,放置过夜至其溶解后配制引物Mix,备用。3.引物Mix的制备3.1PCR引物稀释浓度为100µM,配制终浓度为0.5μM的PCR引物Mix;3.2延伸引物Mix的制备;3.3PCR体系的制备。分别取1.8µlWater(HPLCgrade),1µl0.5µMPCR引物Mix,0.5µl10xPCRBuffer,0.4µl25mMMgCl2,0.1µl25mMdNTPMix,0.2µl5U/µlPCREnzyme至1.5ml管配制PCRMix。加入1µlDNA,涡旋震荡和离心;3.4PCR反应程序:预变性95℃2min;然后95℃30sec、56℃30sec、72℃60sec共45个循环;72℃5min,最后4℃保存。4.SAP混液的配制4.1分别取1.53µl超纯水,0.17µlSAPBuffer,0.30µlSAPEnzyme(1.7U/µl)配制SAP混液(该体系为单孔);4.2每一个孔加入2µlSAP混液,完成后,用膜把板封好,涡旋震荡和离心;4.3将封好的板放上PCR仪上进行以下程序:37℃40min,85℃5min,4℃保存。5.延伸反应5.1分别取0.619µl灭菌去离子水,0.2µliPLEXGOLDBuffer,0.2µliPLEXTerminationmix,0.94µliPLEX延伸引物混合物,0.041µliPLEXEnzyme(该体系为单孔)配制iPLEX延伸混液;5.2加入2µl上述iPLEX延伸混液并混合,涡旋震荡和离心;5.3根据以下程序进行热循环:step1:94℃30s;step2:95℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,52℃5s,80℃5s,重复40个循环;step3:72℃3min;step4:4℃长期保存。6.脱盐处理6.1洁净树脂(Resin)铺平在384/6mgdimpleplate上,风干最少10分钟;6.2在样本板的每一个有样本的孔里加入16µl水。完成后,用膜把板封好,涡旋震荡15min,然后2000rpm离心5min;6.3加入6mg洁净树脂(Resin):轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimpleplate上,然后将dimpleplate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动),让树脂掉到孔里。用膜把板封好,放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。以3200g将板离心5分钟。7.启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。8.将点样后的SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析,检测结果使用TYPER4.0软件自动解读质谱检测的分子量峰,转化显示为SNP位点所对应的分子量质谱峰图。当前第1页1 2 3 
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