本发明属于生物技术领域，具体涉及ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒。
背景技术：
肺癌是当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居恶性肿瘤第一位，其中约80％～85％肺癌患者是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)。在我国,肺癌也是第一大肿瘤,占全部恶性肿瘤死亡的25.0％。且发病率和死亡率仍在陆续上升,据统计,每年新增肺癌病例达50万～60万。世界卫生组织(who)预测,到2025年,中国每年新增肺癌病例将超过100万,成为世界第一肺癌大国。多年来我国肺癌患者的5年生存率无明显提高。然而，近年美国fda和中国cfda批准的用于nsclc靶向治疗的表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂(egfr-tki，如吉非替尼、埃克替尼和奥西替尼等)、alk激酶抑制剂和ros1激酶抑制剂(如克唑替尼、艾乐替尼等)能显著改善患者的生存。中国晚期原发性肺癌诊治专家共识、美国国立综合癌症网络(nccn)临床实践指南以及欧洲肿瘤内科学会(esmo)肺癌共识均明确建议：晚期nsclc患者在接受治疗之前应先检测egfr、alk和ros1基因，根据基因状态决定相应的治疗策略。
目前ros1基因融合常用的检测技术有荧光原位杂交fish、免疫组织化学immunohistochemistry(ihc)和实时逆转录荧光pcr(rt-qpcr)。
荧光原位杂交fish特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，检测结果判读主观性和专业性强。ihc也存在样本处理周期长，且结果受融合蛋白表达量和抗体的特异性和敏感性的影响大，结果判断不确定性大。rt-qpcr具有所需样本少，操作简单，耗时短，成本低，结果判断简单等优点，在临床检测中具有重要作用。但目前市面上的ros1融合检测试剂盒灵敏度低，可检测的融合类型少。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供ros1基因融合检测引物和试剂盒。
本发明的另一目的在于提供ros1基因融合检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
ros1基因融合检测引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：
f1：tccttggagcaaaagccca(seqidno:1)
f2：agtggggcccgggcagg(seqidno:2)
f3：ccagcactgtgcagggcagcaaca(seqidno:3)
f4：cggatttctctactttttcgt(seqidno:4)
r1：gtattgaatttttactccctt(seqidno:5)
f5：tccttggagcaaaagccca(seqidno:7)
f6：ggagttgatgctgcggct(seqidno:8)
f7：agtggggcccgggcagg(seqidno:9)
f8：ccagcactgtgcagggcagcaaca(seqidno:10)
f9：cggatttctctactttttcgt(seqidno:11)
r2：aaatattccaactataat(seqidno:12)
f10：ccaagctggaaaagacaatt(seqidno:14)
f11：caggtgctggatttttcttacc(seqidno:15)
f12：aaagacacaagtggggaaatcaaa(seqidno:16)
r3：ttataagcactgtcacccc(seqidno:17)
f13：tatatggggcgagactagct(seqidno:19)
r4：agagtcagtttttcccgaggg(seqidno:20)。
一种ros1基因融合检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，该试剂盒还含有检测探针组，其核苷酸序列如下所示：
p1：cccaaataaaccagg(seqidno:6)
p2：tttttggataccagaaac(seqidno:13)
p3：gattaaagaatcaaaaa(seqidno:18)
p4：agaggagattgaaaat(seqidno:21)
或者为该些序列的核苷酸反向互补序列。
进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团选自fam、joe、hex、vic、cy5、tet中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自tamra、mgb、bhq中一种。
进一步的，该试剂盒还含有逆转录酶，逆转录缓冲液，荧光定量pcr反应缓冲液，dntps，dnapolymerase，阴性对照品，阳性对照品，内标引物f14(seqidno:22)、r5(seqidno:23)以及内标探针p5(seqidno:24)。
一种ros1基因融合检测方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取rna；
2)将所提取的rna进行逆转录反应，获得cdna，逆转录体系中含有上述所示的引物r1～r5；
3)以cdna为模板利用上述所述的引物组进行荧光定量pcr扩增反应并收集荧光信号；
4)结果分析：根据荧光信号判定样品是否存在相应ros1基因融合类型；
上述方法不用于疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2)中逆转录反应体系为：
进一步的，步骤3)中，荧光定量pcr扩增反应体系分为4个反应体系进行，分别记为体系a～d，具体信息如下：
体系a：
体系b：
体系c：
体系d：
进一步的，步骤3)中荧光定量pcr扩增反应程序为：94～96℃、4～7min；94～96℃、13～17s，58～62℃、28～32s，71～73℃、13～16s，循环40～50次，同时收集荧光信号。
进一步的，步骤4)中结果分析的具体过程如下：
①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明该样品存在ros1基因融合；
②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，但检测样本无ct值且曲线无明显的指数增长期，说明该样品不存在ros1基因融合或样本中ros1基因融合类型的含量低于试剂盒最低检测限或为试剂盒涵盖范围以外的ros1融合。
本发明的有益效果是：
ros1基因可以和多种基因发生不同的融合，本发明可检测多达13种ros1基因融合类型。引物和探针经过优化和筛选，灵敏度可达100copies/μl，且特异性高。
附图说明
图1为本发明对13种ros1基因融合类型的阳性rna样品的检测结果；
图2为本发明对浓度为102copies/μl的13种阳性rna样品的检测结果；
图3为本发明方法对临床ffpe样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1ros1基因融合检测引物及探针
ros1基因可以和多种基因发生融合，如cd74、ezr、sdc4、slc34a2、tpm3、lrig3、gopc等。本发明前期通过引物设计原则并结合实际情况设计了大量引物和探针，然后通过对大量引物和探针进行优化和筛选，筛选出高灵敏和高特异性的多重rt-qpcr引物组和检测探针，可检测多达13种ros1基因融合类型。所获得的引物组和探针序列分别如表1所示。
表1ros1基因融合检测引物及探针序列
实施例2ros1基因融合检测试剂盒
本实施例检测试剂盒包括：
1)ros1基因融合检测引物f1～f13、r1～r4以及探针p1～p4(具体序列见表1)；
2)内标引物f14、r5以及探针p5(具体序列见表1)；
3)试剂盒还包含阴性对照品(阴性对照为2个，分别是ddh2o和野生型293t细胞的rna，以下简称293rna)和阳性对照品(人工合成表1中ros1基因融合类型的rna序列和ros1融合质粒)。多重质控避免检测结果的假阳性和假阴性。
4)逆转录酶、逆转录缓冲液、dnapolymerase、dntp以及实时荧光pcr反应缓冲液。
实施例3ros1基因融合检测方法
1)从样品中提取rna；
2)将所提取的rna进行逆转录反应(逆转录体系试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，获得cdna，逆转录体系中含有引物r1～r5；
逆转录体系为：
逆转录反应程序为：50℃、15min；85℃、2min，10℃保温。
3)以cdna为模板进行荧光定量pcr扩增反应并收集荧光信号；
pcr反应体系(pcr反应试剂采购自南京诺唯赞生物科技有限公司)分4个体系(体系a～d)进行pcr检测，体系a～d具体如下：
体系a：
体系b：
体系c：
体系d：
pcr扩增反应程序为：利用实时荧光定量pcr仪(abi7500)进行pcr扩增，pcr条件为：95℃、5min；95℃、15s，60℃、30s(收集荧光信号)，72℃、15s，循环45次。
4)结果分析：
①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明该样品存在ros1基因融合；
②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，但检测样本无ct值且曲线无明显的指数增长期，说明该样品不存在上述13种ros1基因融合类型或样本中该13种ros1基因融合类型的含量低于试剂盒最低检测限或为试剂盒涵盖范围以外的ros1融合。
实施例4阳性对照品检测
1)将人工合物的表1中13种ros1基因融合类型的rna序列分别进行逆转录获得13种cdna，逆转录体系和反应程序同实施例3。
2)分别以上述13种cdna为模板进行pcr检测；pcr反应体系和反应程序同实施例3。阳性检测结果如图1所示，从中可以看出本发明对13种ros1基因融合类型的阳性rna样品均能获得明显的扩增曲线。同时对阴性对照品ddh2o(ntc)和野生型293t细胞的rna(简称293rna)不具有扩增曲线。
实施例5灵敏度检测
将上述阳性对照品(13种ros1基因融合类型的阳性rna样品)进行梯度稀释，使稀释后的阳性对照品的rna浓度分别为104、103、102、101copies/μl，根据上述的实施例3的检测方法进行灵敏度检测实验。同时设置ntc非模板对照(ddh2o阴性对照)以及野生型293t细胞rna的阴性对照(293rna)。
检测结果如图2所示，本发明对浓度为102copies/μl的13种阳性rna样品均具有很好的检测效果，且对ntc和293rna(野生型rna)不具有扩增曲线。说明本发明方法的灵敏度可达102copies/μl。
实施例6临床样品检测
将3份临床ffpe样本分别按照实施例3所述的方法，提取rna并进行荧光定量检测。同时设置阳性对照组，以及ntc非模板对照(ddh2o阴性对照)以及野生型293t细胞rna的阴性对照。
检测结果如图3所示，本发明方法对上述3份临床样本rna均具有很好的检测效果，出现明显的扩增曲线，对ntc和293t细胞rna(293rna)不具有扩增曲线。说明该3份临床样本均存在ros1基因融合；另外，通过二代测序确认了该3份临床ffpe样本的确存在ros1基因融合，且融合类型分别为sdc4exon4：ros1exon34、ezrexon10：ros1exon34、cd74exon6：ros1exon34基因融合类型，说明本发明方法具有很好的准确性和适用性，可用于临床样品的快速检测。综上所述，本发明可检测多达13种ros1基因融合类型。引物和探针经过优化和筛选，灵敏度可达100copies/μl，且特异性高。内标用于体系逆转录和扩增监控，保证检测正常进行。另外，试剂盒还包含阴性和阳性对照。多重质控避免检测结果出现假阳性和假阴性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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