对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测引物组及检测试剂盒的制作方法

文档序号:15457618发布日期:2018-09-15 01:34

本发明涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测引物组,还涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR 检测试剂盒,属于海洋生物病原检测技术领域。



背景技术:

传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV)是已知对虾病毒中最小的病毒,病毒粒子大小为22nm,是无囊膜二十面体,线性单链DNA,长度约3.9kb,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF)。IHHNV于1981年在美国夏威夷地区的细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)中首次报道,已在世界范围内广泛流行。IHHNV感染凡纳滨对虾和斑节对虾后不会造成对虾大量死亡,但可致幼虾生长缓慢、畸形,规格参差不齐,称为慢性矮小残缺综合症(Runt-deformity syndrome,RDS),每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,已被世界动物卫生组织(The World Organisation for Animal Health, OIE)列为须向其申报的甲壳类重要病原。

目前荧光定量PCR检测技术是进行对虾病毒定量及早期预防的主要手段,基于SYBR Green建立的荧光定量PCR方法能迅速定量检测IHHNV,且价格低廉,操作简便,适合大规模推广。García等2015年建立了基于SYBR Green 的IHHNV荧光定量PCR检测方法,最低可检测到81拷贝的IHHNV DNA,此检测方法灵敏度有待进一步提高。因荧光定量PCR检测方法是进行对虾病毒定量及早期预防的重要有效手段,所以建立高灵敏度的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。因此,有必要提出有效的技术方案,解决上述问题。



技术实现要素:

本发明针对上述现有技术中存在的灵敏度不高的问题,提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测引物组及检测试剂盒。该检测试剂盒灵敏度高、特异性好、操作简单快速。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测引物组,所述荧光定量PCR检测引物组,包括正向引物和反向引物,所述正向引物序列为:5'-GGGAGTTACCTTTGCTGC-3';所述反向引物序列为: 5'-GGTCCGTCTACTGCGTCT-3'。

一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括:

(1)SYBR Green实时荧光定量PCR反应液管,内装2×荧光定量PCR buffer及如权利要求1所述的荧光定量PCR检测引物混合物;

(2)阴性对照管,内装SPF对虾核酸;

(3)标准品管,分别内装传染性皮下及造血组织坏死病毒108,107,106, 105,104,103,102,10,1拷贝DNA阳性克隆。

有益效果:

(1)灵敏度高:可以检测到1拷贝的传染性皮下及造血组织坏死病毒。

(2)特异性好:与其它6种常见对虾病原及对虾组织不发生交叉反应。

(3)操作简单、快速:将传染性皮下及造血组织坏死病毒正反引物加入荧光定量PCR反应液中,简化了操作步骤。

附图说明

图1为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量PCR 检测灵敏度及标准曲线示意图;其中

图1(a)为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量 PCR检测灵敏度示意图;

图1(b)为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量 PCR检测标准曲线示意图;

图2为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量PCR 特异性检测及熔解曲线示意图;其中

图2(a)为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量 PCR特异性检测示意图;

图2(b)为试验例1中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光定量 PCR检测熔解曲线示意图。

具体实施方式

本发明一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测引物组,根据对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的全基因序列重新设计引物,正反引物序列分别为:所述正向引物序列为: 5'-GGGAGTTACCTTTGCTGC-3';所述反向引物序列为:5'-GGTCCGTCTACTGCGTCT-3'。

本发明一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括:

(1)SYBR Green实时荧光定量PCR反应液管,内装2×荧光定量PCR buffer及如权利要求1所述的荧光定量PCR检测引物混合物;

(2)阴性对照管,内装SPF对虾核酸;

(3)标准品管,分别内装传染性皮下及造血组织坏死病毒108,107,106, 105,104,103,102,10,1拷贝DNA阳性克隆。

试验例1

一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的荧光定量PCR检测试剂盒,所述试剂盒的使用方法如下:

(1)采用25μl荧光定量PCR反应体系,具体如下:

正反引物序列分别为:所述正向引物序列为: 5'-GGGAGTTACCTTTGCTGC-3';所述反向引物序列为:5'-GGTCCGTCTACTGCGTCT-3';

(2)SYBR Green实时荧光定量PCR反应程序,具体为:95℃变性30s, 1个循环;95℃变性5s,65℃退火延伸30s,读取荧光数据,35个循环,反应结束。

本发明方法灵敏、特异、便于操作。根据对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的全基因序列重新设计引物,采用荧光定量PCR实时检测荧光染料的荧光强度,并根据分析软件确定样品病毒含量,此试剂盒可应用于定量研究对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒在对虾体内的增殖、对虾健康苗种培育等过程的传染性皮下及造血组织坏死病毒检测,具有较高的推广应用价值。

如图1所示,108-1拷贝的传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA均超过了阈值。

如图2所示,传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA超过了阈值,同时检测的其余对虾病原白斑综合征病毒、传染性肌肉坏死病毒、肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、黄头病毒、虾肝肠胞虫及阴性对照(健康虾组织DNA) 均未超过阈值。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此,无论从哪一点来看,本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明,权利要求书指出了本发明的范围,而上述的说明并未指出本发明的范围,因此,在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

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