一种简单芽孢杆菌S62及其应用的制作方法

文档序号:15457391发布日期:2018-09-15 01:28

本发明属于微生物技术领域,涉及一株来源于察尔汗盐湖的简单芽孢杆菌S62,尤其涉及一种简单芽孢杆菌S62及其应用。



背景技术:

马铃薯属于茄科茄属一年生草本,营养丰富,含有较高的蛋白质、维生素和无机盐。随着2015年我国马铃薯主粮化战略的启动,马铃薯种植面积铃薯种植面积不断扩大,病害的发生也越来越严重。其中,镰刀菌干腐病是一种重要的马铃薯贮藏期病害之一,常导致马铃薯块茎品质降低和商品薯率大幅下降,严重影响其食用价值和经济价值,成为限制马铃薯产业发展的主要因素。在众多病原真菌中以接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)和茄病镰刀菌(Fusarium solani)和为主要优势病原菌。目前主要采用化学杀菌剂对其进行控制,但以化学防治为主的措施不但不能遏制土传病害上升的趋势,而且还会抑制土壤中的有益微生物;化学药剂的频繁使用会导致病原菌产生抗药性、污染环境和危害人类健康。生物防治因其对环境、生态和人类健康安全的优点,在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用。

目前国内学者所研究获得的马铃薯干腐病生防菌株包括:萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)、多产色链霉菌1(Streptomyces polychromogenes 1)、球孢链霉菌球孢亚种(Streptomyces globisporus subsp.Globisporus)、锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvlus)、放线菌DO1、一株枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、俄罗斯木霉(Trichoderma rossicum)、球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。此外,部分学者就马铃薯非亲和菌株粉红单端孢(Trichothecium roseum)菌丝细胞壁提取物对马铃薯干腐病的拮抗作用进行了研究。同时,部分学者对拮抗马铃薯干腐病的机理机制进行了进一步的研究,研究表明寡雄蛋白处理能提高与马铃薯块茎组织苯丙烷代谢相关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸脱氢酶(CAD)、肉桂酸羟化酶(C4H)和4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)的活性及相关基因的表达;同时抗性物质总酚、类黄酮及木质素含量也因寡雄蛋白处理而提高。

目前看来,人们既可以从土壤中分离得到简单芽孢杆菌,也可以从植物内部分离得到。更重要的是,简单芽孢杆菌的应用研究也已取得一定成效。人们可以利用简单芽孢杆菌的促生作用来促进黑麦种子的萌发以及植株的生长;人们也可以利用简单芽孢杆菌的生防作用来防治油菜菌核病和水稻白叶病等病害。特别需要注意的是,与简单芽孢杆菌相接近的菌可分解有机磷。在此基础上,本发明从盐湖湖泥极端环境中分离、纯化得到简单芽孢杆菌,并将其运用于马铃薯窖藏病害防治的突破,使得生物防治马铃薯窖藏病害成为可能,同时为盐湖等极端环境资源的利用提供了依据,奠定了基础。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一株从察尔汗盐湖湖水中分离纯化得到的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)S62,旨在解决的技术问题是针对目前马铃薯干腐病生物防治技术的不足。

本发明具体通过以下技术方案实现:

本发明提供的一种简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)S62,该菌株已进行保藏,保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心;保藏地址:中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼;保藏日期:2016年9月12日;保藏编号:GDMCC NO:60079。

本发明简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)S62采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。

本发明简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)S62采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。革兰氏阳性菌,球形,有荚膜,无鞭毛,大小为0.6-0.8μm×0.4-0.6μm。

本发明简单芽孢杆菌S62的16S rDNA的序列为SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的简单芽孢杆菌S62在植物病害生物防治中的应用,所述的植物病害为镰刀菌引起的病害,所述的病害具体为干腐病、枯萎病、根腐病等,所述的植物为茄科或禾本科作物,优选为马铃薯。

优选的,所述的简单芽孢杆菌S62的菌悬液或次级代谢产物在植物病害生物防治中的应用也在本发明的保护范围内。

所述的简单芽孢杆菌S62菌悬液的制备方法为:在培养1d后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100ml ATCC213改良培养液的培养瓶中,37℃、200r/min-1培养2h,用血球计数板计数为:1.0×108cfu/ml。

所述的简单芽孢杆菌S62次级代谢产物的制备方法为:在培养1d后的菌落边缘取菌苔接种到有800ml ATCC213改良培养液的培养瓶中,37℃200r/min-1培养5d,培养液经4000r/min离心15min得上清液,萃取有机相旋转蒸发得浸膏,用无菌水将浸膏配制为20mg/ml,用0.25μm微孔水性滤膜过滤得母液。

所述的ATCC213改良培养液为:MgSO4·7H2O 10g,CaCl2·2H2O 0.2g,KCl 5g,蛋白胨2.5g,酵母膏10g,NaCl 30g,琼脂粉12g,蒸馏水至1000ml,pH 7.2-7.4。

本发明所述的简单芽孢杆菌S62在作为制备防治作物病害药物中的应用,通过常规的液体或固体培养,获得包括细菌菌体培养物,通过常规的液体发酵生产,然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种,或吸附载体按一定比例混合后,制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂;所述的作物包括茄科和禾本科作物,优选为马铃薯。

当然本发明所述的简单芽孢杆菌S62的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治作物病害药物中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明简单芽孢杆菌S62防治作物病害的方法也属于本发明的保护范围,该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理;所述喷雾为该简单芽孢杆菌S62的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。

本发明的有益效果为:

本发明针对马铃薯收获后窖藏过程中严重影响马铃薯品质的干腐病为靶标,从察尔汗盐湖湖水中分离筛选到一种简单芽孢杆菌属菌株s62,其本身可显著拮抗马铃薯干腐病病原菌,且菌悬液和次级代谢产物均对马铃薯干腐病病原菌有较好的防效,同时对马铃薯安全。本发明能够有效拮抗和控制马铃薯干腐病病原菌,且原料来源广泛,成本低,对环境安全。

附图说明

图1是本发明实施例简单芽孢杆菌S62经Biolog系统鉴定后的结果;

图2是本发明实施例简单芽孢杆菌S62本身与马铃薯干腐病病原真菌的培养皿对峙培养结果;

图3是本发明实施例简单芽孢杆菌S62次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌青9A-5-2结果;

图4是本发明实施例简单芽孢杆菌S62次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌青9A-5-10结果;

图5是本发明实施例简单芽孢杆菌S62次级代谢产物正丁醇萃取物拮抗病原真菌65B-2-6结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型,均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1简单芽孢杆菌S62的分离与鉴定

1.1简单芽孢杆菌S62的分离纯化

1)水样前处理:在无菌条件下,将水样混匀,用装有0.22μm孔径的滤膜的滤器过滤,在滤膜上富集菌体。用于富集的水样量达到30ml时,取下滤膜,放入装有3ml无菌海水的玻璃试管中,为10-1水样。

2)土样前处理:取适量土样,风干(20d左右),120℃处理1h。称取10g处理好的土样,加入90ml无菌海水,放入已灭菌好的装有玻璃球的三角瓶内,充分振荡30min,静置后吸取上清液,此上清液为10-1土样。将上述10-1样品依次稀释为10-2和10-3倍,吸取150μl各梯度样品,分别涂布于各培养基平板上,每个样品重复3次。涂布后的平板倒置于培养箱中,分别于28℃和37℃下倒置培养,观察到有菌落出现,挑取单菌落,纯化。纯化后的菌株保存于试管斜面,并放置在4℃冰箱中。

1.2菌株的鉴定

1.2.1形态学鉴定

将菌株于培养基上进行培养,光学显微镜下观察其形状、大小、鞭毛和荚膜等形态学特征。

1.2.1.1革兰氏鉴定

通过革兰氏染色来确定革兰氏阳性和阴性,具体操作步骤如下:接菌针挑取少许菌苔,涂布在干净玻片上的一滴无菌水中,酒精灯灼热固定,固定完成后滴加结晶紫的混合液染色1min,无菌水冲洗,滴加碘液作用1min,无菌水冲洗,紧接着用95%的乙醇溶液脱色,直至洗脱液无色,最后用番红染液染色2~3min,冲洗干净后进行镜检。结果如表1所示。

1.2.1.2鞭毛鉴定

接种针挑取少许菌苔,涂布在干净玻片上的一滴无菌水中,酒精灯灼热固定,固定完成后滴加混合染液(丹宁酸5.0g、FeCl3 1.5g、福尔马林(15%)2.0ml、NaOH(1%)1.0ml、蒸馏水100ml)染色10min,无菌水冲洗,滴加2g/ml的AgNO3溶液染色30~60s,冲洗干净后进行镜检。结果如表1所示。

1.2.1.3荚膜鉴定

接种针挑取少许菌苔,涂布在干净玻片上的一滴无菌水中,滴加一滴墨汁与菌液完全混匀,盖玻片将混合液刮成薄膜,空气中风干,甲醇固定1min,滴加0.5%的番红染液冲去残余甲醇的同时染色30s,风干后镜检。结果如表1所示。

表1菌株s62形态学鉴定结果

由此可见,菌株S62为革兰氏阳性菌,球形,有荚膜,无鞭毛,大小为0.6-0.8μm×0.4-0.6μm。

1.2.2生理生化测定

BIOLOG鉴定系统进行糖代谢的特性研究;API实验进行生理生化特性的获得。

1.2.2.1BIOLOG系统分析鉴定

Biolog自动微生物分析系统主要根据细菌利用95种碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(显色反应)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度反应)进行鉴定。系统测定细菌鉴定微平板上的两套数据,即显色反应的吸光度和浊度反应的浊度,基于这些特征性的反应模式或“指纹图谱”,通过智能软件Microlog 3(5.2)将待鉴定菌种的图谱与数据库参比,获得最大限度的匹配,鉴定结果如图1(a,b)所示。

Biolog软件将读取的96孔微平板反应结果如图1a所示。系统软件与数据库的匹配程度列出4个结果,每个结果均显示3种重要的参数,即可能性Probability(PROB),相似性Similarity(SIM)和位距Distance(DIS)(图1b)。系统得到的3个参数与数据库匹配后在ID地址栏里显示出有一个最佳的匹配名称:Bacillus subtilis。

1.2.2.2API生理生化鉴定

将菌株s62的新鲜菌苔接种于培养液中,37℃培养1~2h,吸取0.05~0.08ml加到盛装有相应底物的微量生化管中;其中硝酸盐还原参照《微生物学实验技术》配制溶液A和B,菌株s62培养后加硝酸盐还原试剂溶液A和B各2滴,混匀,立即观察结果。其余生化管均采取穿刺法,将已接种的生化管套上无菌塑料帽,直立于三折吸塑短架内,于35~37℃培养箱中培养,其中淀粉的生化管培养后加lugal氏碘液2滴,观察结果。

表2菌株s62的生理生化特征

利用生化鉴定管检查菌株s62的生理生化反应,鉴定结果见表2。从表2可以看出:培养物可水解明胶,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能利用半乳糖、淀粉和酪蛋白。

1.2.3分子鉴定

DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选用细菌通用引物对F27:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′,P1541:5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′。选取特定的引物,反应条件为94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸75s,50μl反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,经克隆测序得到序列结果。所得到的16SrDNA全序列上传到网站https://www.ezbiocloud.net进行序列对比,进而确定其属名。

对菌株s62的16SrDNA进行测序,测得序列结果如SEQ ID NO:1所示。将此序列上传到https://www.ezbiocloud.net进行序列比对,最终确定其属名为:Bacillus simplex。

基于以上特征,所述菌种其分类命名为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)S62,已于2016年9月12日保存在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:60079。

实施例2简单芽孢杆菌S62对病原真菌的拮抗作用

1.1菌培养

将4株病原真菌(青9A-4-13、青9A-5-2、青9A-5-10、65B-2-6)接种于PDA培养基,置于28℃的恒温培养箱培养一周;将简单芽孢杆菌S62接种于ATCC213改良培养基,置于37℃培养箱培养1d。

1.2对峙培养

采用“十字划线法”,将病原真菌打孔为直径5mm的菌饼放于距离中心简单芽孢杆菌S62(菌落直径为5mm)2.5cm处,在直径9cm的培养皿中进行对峙培养。结果如表3所示。

表3s62与4株马铃薯干腐病病原真菌的对峙培养

由表3和图2可得,培养时间不同,s62对4株病原真菌的拮抗作用不同,随着培养时间的逐渐增加,4株病原真菌的菌落半径逐渐增大,s62对4株病原真菌的抑菌圈宽度逐渐减小。培养14d后,s62对青9A-4-13、青9A-5-2、青9A-5-20和65B-2-6的抑菌圈宽度分别为:0.09cm、0.20cm、0.38cm和0.33cm。说明s62所产生的大分子物质对4株马铃薯干腐病病原真菌具有一定的拮抗作用。

实施例3马铃薯活体复筛

1.1发酵液的制备

将实施例2中培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中,置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养5d后备用。

1.2菌悬液的制备

将实施例2中培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中,置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡2h,摇匀后备用。

1.3试验方法

用直径5mm的打孔器在消毒后的马铃薯果实上刺两个直径为5mm,深为3mm的伤口(马铃薯果实用2%NaClO溶液浸泡10min之后,用自来水冲洗干净,自然晾干)。先接种40μl病原菌悬浮液,随后接种同体积简单芽孢杆菌S62悬浮液。对照先接种40μl病原菌悬浮液,随后接相同体积的无菌水。将果实放在托盘上,并放入人工培养箱(28℃,黑暗、RH40%-50%)培养两周,观察果实的发病情况。每个处理3个马铃薯,实验重复3次。

1.4实验指标的测定

在接种后7d、14d、21d后分别观察坏果率和测定失重率、病斑深度及宽度。失重率采用称重法测定;坏果率采用观察法测定,果实上出现病斑、腐烂、裂痕均为坏果。

失重率(%)=贮藏期失重量/入贮时总重量×100

坏果率(%)=坏果数/贮藏总果数×100

Microsoft excel 2010版和Spss 19.0进行数据统计与分析。

表4s62与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用

由表4可以看出,培养两周后,4株病原真菌的处理组和对照组的失重率之间无显著差异,在坏果率和病斑深度之间差异显著。就坏果率而言,其变化范围为:33%~100%,可见s62与4株病原真菌之间的拮抗作用有差异。

实施例4简单芽孢杆菌S62次级代谢产物对病原真菌的拮抗作用

将实施例2中培养的简单芽孢杆菌S62接种于液体培养基中,置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养5~7d后,在大型离心机中4000r/min离心15min,取上清液分别与乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等体积盛装于分液漏斗中摇匀,进行分液萃取。将萃取得到分层液体分别进行旋转蒸发,用甲醇溶解出旋蒸瓶中的浸膏,制得的粉末状物质保存与4℃冰箱中备用。

将上述制备得到的粉末用无菌水配置成浓度为20mg/ml的原液,置于20000r/min、4℃的低温离心机中离心15min,然后抽滤灭菌,最终梯度稀释为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml和1mg/ml四个浓度梯度备用。采用“牛津杯”法进行简单芽孢杆菌S62次级代谢产物与病原真菌的对峙培养,牛津杯中次级代谢产物溶液的量为200μl。结果如表5所示。

表5s62次级代谢产物与4株病原真菌的拮抗作用

由表5和图3~5可知,随着培养时间的逐渐增加,4株马铃薯干腐病病原真菌的菌落半径逐渐增加,s62与其所形成的抑菌圈的宽度逐渐缩小,甚至为零。简单芽孢杆菌S62次级代谢产物不同有机溶剂萃取物以及同一有机溶剂萃取物的不同浓度梯度对4株病原真菌的拮抗作用存在差异。特别需要指出的是,除病原真菌青9A-4-13外,简单芽孢杆菌S62次级代谢产物正丁醇萃取物对青9A-5-2、青9A-5-10和65B-2-6均具有一定的拮抗作用,且拮抗作用有强到弱依次为:青9A-5-2(20mg/ml浓度梯度下培养14d的抑菌圈宽度为:0.25cm)、65B-2-6(0.15cm)和青9A-5-10(0.10cm)。

实施例5s62次级代谢产物马铃薯活体复筛

在上述实施例的基础上,进一步利用简单芽孢杆菌S62次级代谢产物进行马铃薯活体复筛实验,结果见表6。

表6s62次级代谢产物与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用

由表6可明显看到,简单芽孢杆菌S62次级代谢产物的3种有机溶剂萃取物均对病原真菌具有非常显著的拮抗作用。经培养皿中培养一周后,各项指标(失重率、病斑深度、病斑宽度和坏果率)在不同处理下均接近于零。但对其他3株病原真菌的拮抗作用因不同有机溶剂、同一有机溶剂的不同浓度梯度而有所不同。

实施例6对马铃薯安全性评价实验

表7一种简单芽孢杆菌s62对马铃薯的安全性评价

由表7可知,只接无菌水的空白对照(CK)与只接简单芽孢杆菌s62的阴性对照的失重率之间无显著差异,且病斑深度、病斑宽度以及发病率等衡量指标指标值均为零,即说明一种简单芽胞杆菌s62对马铃薯安全。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种简单芽孢杆菌S62及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1405

<212> DNA

<213> 简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)

<400> 1

tgaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt 60

acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccggc 120

ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa tggctttatg ggattcgctt 180

accttcgcag gtttgcagcc ctttgtacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 240

taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac 300

cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360

taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgtccc 420

ccgaagggga aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct 480

tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 540

ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc 600

actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg 660

gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcgcctcag tgtcagttac agaccagaaa 720

gtcgccttcg ccactggtgt tcctccaaat ctctacgcat ttcaccgcta cacttggaat 780

tccactttcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctcca cggttgagcc 840

gtgggctttc acatcagact taaggaacca cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg 900

gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc 960

tggttaggta ccgtcaaggt accagcagtt actctggtac ttgttcttcc ctaacaacag 1020

aactttacga cccgaaggcc ttcttcgttc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc 1080

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc cattacctca 1200

ccaactagct aatgcgccgc gggcccatct ataagtgaca gcgtaaaccg tctttccatc 1260

ttctctcatg cgagaaaaga acgtatccgg tattagctcc ggtttcccga agttatccca 1320

gtcttatagg caggttgccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaatct cagggagcaa 1380

gctcccatcg attcgctcga ctgca 1405

再多了解一些
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