本发明属于微生物领域，涉及一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法。
背景技术：
在土壤中，绝大多数微生物分布在土壤矿物、根际等固相表面，形成微菌落或生物膜。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种细胞聚集体，由细菌和自身分泌的胞外基质组成，是微生物面对复杂外界环境的一种重要的生存方式。
生物膜细胞与游离细胞在很多方面是完全不同的，形成生物膜的细胞的基因表达与游离细胞的基因表达差异明显，生物膜中的细胞表达的模式比游离的细胞更加复杂，生物膜与游离细胞相比，细菌自身分泌胞外物质eps能够保护细胞免受干旱、氧化作用、有毒化合物、重金属离子，抗生素，紫外线照射的侵害，以及原生动物的捕食。生物膜群落中产生的胞外酶能够降解胞外的营养物质，使之成为细胞可利用的能源物质。此外，eps组分能够固定细胞，使细胞紧密结合，细胞之间产生强烈的相互作用，如：细胞与细胞之间的交流合作。
在多物种生物膜中，种间相互作用显著影响细菌的分布以及生物量的产生，给人们的生活带来各种影响。例如：一方面多物种生物膜内微生物之间相互作用可提高病原菌的抗性或者毒力从而引起人类疾病，对人类的健康造成威胁；另一方面，生物膜中的竞争和合作也能发挥积极作用，如降解有机污染物、提供生物屏障等，从而影响生物膜整体功能及周围环境，这对于人类的健康和活动有着重要影响。如何认识生物膜以及如何趋利避害使生物膜造福于人类已成为当今世界的重要课题。
目前，大多数有关生物膜的研究都是采用的简化法，即单一物种生物膜。然而，在土壤中几乎所有的生物膜都包含有多个物种，不同物种间的相互作用对生物膜的形成和结构功能的影响不同。土壤中微生物群体具有高度的多样性，据估计1g森林土壤有105-106种不同的微生物，总量达到109个。形成土壤生物膜的不仅只有细菌，还有酵母、真菌、藻类、原生动物等，导致土壤生物膜这个集合体在分类、功能水平上的多样化。
演替是研究生态学的一项重要内容，它是一种特定环境中某个生境的生物学变化过程，其中植物和动物生态系统中演替被广泛研究，但是微生物在自然界中分布广泛，却鲜有研究微生物的演替过程。这是由于利用传统的依赖实验室培养微生物的方法的局限性导致研究微生物的演替很困难。然而，随着分子生物学的发展，能够快速调查研究微生物群落的结构和组成，为研究微生物群落水平的演替过程和竞争动力学模型提供了绝佳的机会。
技术实现要素：
本发明的目的是鉴于目前鲜有对土壤生物膜的形成过程、群落结构的变化趋势等进行的研究，从建立土壤生物膜模型入手，借助现代的分子生物学技术，研究土壤生物膜的早期演替过程和种间互作，从而为人类的健康和活动带来积极作用。
本发明的具体技术方案如下：
一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法，它包括以下步骤：
(1)制备初始接种液：将过筛土样与无菌去离子水混合，50-150rpm振荡过夜，使得土壤中的细菌溶到水中，然后将琼脂涂到灭菌的玻片表面，直到琼脂表面变硬，将涂满琼脂的玻片放到土样中，让玻片接触到液相层又不干扰固相层，25-30℃、10-50rpm摇床振荡3-10天，使得细菌充分与玻片表面接触，最后取出玻片，将琼脂刮取下来并加入pbs溶液吹打混匀，作为流动生物膜的初始接种液；
(2)建立流动池生物膜：将涂有琼脂的玻片平铺在流动槽中，将上述得到的初始接种液接种到流动槽中，超净台室温静置1-6h，然后向流动槽中通入灭菌的土壤浸提液并以5-10ml/min的流速循环回流，控制流动槽内的温度为20-30℃，使细菌在玻片上形成生物膜，最后间隔取样，每次取两块玻片，一块用于分析土壤生物膜群落动态组成和多样性，另一块用来分离鉴定土壤生物膜中可培养的细菌；
(3)土壤生物膜群落动态组成和多样性分析：将形成生物膜的玻片用土壤dna提取试剂盒提取总dna，设计通用引物进行pcr扩增，切胶回收pcr产物，进行高通量测序，根据测序结果对不同时期的土壤生物膜群落动态组成和多样性进行分析；
(4)土壤生物膜中可培养细菌的分离鉴定：从形成生物膜的玻片上刮取琼脂并加入生理盐水，振荡、离心，取上清，逐级梯度稀释涂平板，37℃培养3-7天，随机挑取单菌落，分离纯化并扩大培养，试剂盒提取总dna，设计通用引物进行pcr扩增，切胶回收pcr产物、纯化后进行测序分析，绘制可培养菌株发育树。
步骤(3)中的通用引物是：
正向引物：5’-actcctacgggaggcagca-3’
反向引物：5’-ggactachvgggtwtctaat-3’。
步骤(4)中的通用引物是：
正向引物：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；
反向引物：5’-ggttaccttgttaggactt-3’。
本发明的有益效果是：
由于土壤环境的复杂性、微生物之间复杂的种间互作关系，导致人们目前对土壤中生物膜的组成与功能所知甚少，并且实验室条件能够在培养基上培养的微生物不超过所有微生物总和的1％，这使得土壤生物膜的评估更为困难。本发明建立了一个研究土壤生物膜多样性以及早期演替的模型，通过组建由土壤微生物组成的流动培养的生物膜，然后利用pcr技术和高通量测序分析，将微生物进行分类，并分离不同时期占主导地位的菌株，从而实现对土壤生物膜微生物群落演替的研究。
一般认为实验室建立的生物膜模型不等同于实际土壤中的生物膜，在长期的实验过程中，生物膜都是暴露在连续低营养的水环境中的，而实际土壤中的有机质是能够通过外界源源不断得到补充的，这会影响生物膜的演替过程。而我们建立的土壤流动生物膜模型，尽量还原了土壤中微生物群落从游离、富集，然后形成生物膜的全过程。使用生物膜初始接种液的原因是确保流动生物膜的建立与土壤真实环境在同一个起点，初始接种液是由7天的生物膜群体组成，一般认为这个时间段是建立生物膜的最好时期。
利用本发明得到的研究结果表明：当微生物定殖到一个新的表面上时，微生物丰度会增加，而随着竞争作用的增强，物种丰度降低，到了演替末期资源多样性增加导致另外一种细菌的丰度增加，并且在生物膜中建立新的空间位点和生态位，同时发现微生物群落的聚集是根据群落的年龄而定。本研究中两种生物膜一开始都是芽孢菌属占据主导地位，随着竞争作用的增强，其它菌属的丰度逐渐增加，而削弱了芽孢菌属的主导地位。
本研究得到的33株菌全部都是革兰氏阴性菌，并且以变形菌门为主，这说明在生物膜形成的早期以革兰氏阴性菌占主导地位，这一结果在很多文献中也有相似的报道。由主成分分析可知，在两种生物膜演替过程中，第一天物种差异不明显，随后差异逐渐加大。因此可得出以下结论：两种生物膜中的微生物群落具有较高的相似性，就总体而言，土壤生物膜以芽孢菌纲、γ-变形菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、梭菌纲以及flavobacteriia纲占主导地位，其中芽孢菌纲在两种生物膜中占绝对优势，随着时间的变化，这几种优势菌发生演替变化，其中高产田土壤生物膜中的芽孢菌纲的绝对优势地位逐渐被β-变形菌纲所取代，而低产田土壤生物膜中的芽孢菌纲的绝对优势地位最终被γ-变形菌纲、β-变形菌纲削弱。
附图说明
图1不同时期高低产土壤生物膜中细菌群落的聚类分析示意图。
图2高产土壤样品生物膜中优势菌随时间变化的试验结果。
图3低产土壤样品生物膜中优势菌随时间变化的试验结果。
图4主成分分析示意图。
图5可培养细菌及其16srdna基因序列进化树。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1供试土壤
供试土壤采自湖北省武穴市大金镇两块毗邻的水稻田，采取的耕作方式相同，但是水稻产量差异明显，因此分别命名为高产田土壤和低产田土壤。采集于2015年11月，所取样品为根际土壤，采用s形线路随机采样，采集混合土样，剔除石砾和水稻残根装入封口袋内，密封好低温保存带回实验室。
1.1.2土壤dna提取所用试剂
dna提取液：100mmtris-hcl(ph8.0)，100mmna-edta(ph8.0)，100mm磷酸钠缓冲溶液(ph8.0)，1.5mnacl，1％/3％ctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide)；
ph6.6磷酸缓冲液；
100mmal2(so4)3溶液；
sds裂解液：0.1mnacl，0.5mtris-hcl(ph8.0)，10％sds；
苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)；
氯仿/异戊醇(24:1)；7.5mch3coonh4溶液；异丙醇；70％乙醇。
1.1.3分离纯化培养基
r2a培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母提出物0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，琼脂15g，去离子水1l。
r2b培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母提出物0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，去离子水1l。
胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，去离子水1l。
1.2.土壤生物膜的建立
1.2.1制备初始接种液
将过筛土样150g与无菌去离子水300ml混合，先150rpm振荡混合30min，随后50rpm振荡过夜，使得土壤中的细菌溶到水中，然后将琼脂涂到灭菌的玻片表面，直到琼脂表面变硬，将涂满琼脂的玻片放到土样中，让玻片接触到液相层又不干扰固相层，28℃、30rpm摇床振荡7天，使得细菌充分与玻片表面接触形成生物膜，最后取出玻片，将琼脂刮取下来并加入pbs溶液吹打混匀，作为流动生物膜的初始接种液；
1.2.2流动池建立生物膜
将涂有琼脂的玻片平铺在流动槽中，将上述得到的初始接种液接种到流动槽中，超净台室温静置4h，然后向流动槽中通入灭菌的土壤浸提液(1kg土壤与1l去离子水混合，30rpm振荡提取1h，过滤后得到的滤液)并以7.5ml/min的流速循环回流，控制流动槽内的温度为25℃，使细菌在玻片上形成生物膜，最后每24h间隔取样，每次取两块玻片，一块用于分析土壤生物膜群落动态组成和多样性，另一块用来分离鉴定土壤生物膜中可培养的细菌；
1.3.土壤生物膜群落动态组成和多样性分析
1.3.1生物膜样本总dna提取
将上述提到的生物膜用omega土壤dna小量提取试剂盒〔e.z.n.a.@soildnakit(过滤柱型)〕，按操作手册提取土壤总dna。提取的总dna经1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，超微量分光光度计(thermonanodrop2000)检测浓度，检测合格后于-20℃保存，用于后续实验。
1.3.2克隆文库的构建
细菌16srdna的pcr引物为通用引物338f(5’-actcctacgggaggcagca-3’)和806r(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)，反应体系为50μl。包括pcr缓冲液，2mmmgcl，250nm引物，400μmdntp，2.5utaqdna聚合酶，6.25mg小牛血清蛋白和10ng模板dna。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，30个循环(包括：94℃变性30s，53℃退火60s，72℃延伸2min)，然后72℃延伸10min。
扩增得到的细菌16srdna片段用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen，usa)切胶回收pcr产物，tris-hcl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
1.3.316srdnapcr产物高通量测序
测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，采用第二代dna高通量测序技术.pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶纯化，tris-hcl洗脱，经2％琼脂糖电泳初步检测浓度.参照电泳初步定量结果，将pcr产物用quantifluortm-st蓝色荧光定量系统(promega公司)进行检测定量.根据定量结果和测序量要求，取pcr产物构建测序文库，建库主要步骤为：1)连接“y”字形接头；2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；3)利用pcr扩增进行文库模板的富集；4)氢氧化钠变性，产生单链dna片段.不同样本合并测序，以接头中包含的不同索引序列(indexsequence)加以区分.使用illuminamiseqpe300测序平台，此测序平台采用桥(bridge)式扩增产生dna簇和边合成边测序的原理，双端测序，读长2×300bp。
1.3.4测序原始数据处理
1、优化序列数据统计。miseq测序得到双端序列数据，以fastq格式存储，分为fq1和fq2两个文件。根据文件中存储的每条read的质量值信息，去除测序质量较低的碱基。方法是在每条read尾部设置50bp的窗口，若平均质量分数低于20，截去末端碱基。根据序列配对关系进行拼接，最小重叠长度为10bp，最大错配率为0.2.拼接后得到优化序列，根据引物和索引序列区分不同样本。2、操作单元(operationaltaxonomicunits，otu)聚类分析为了便于分析，将相似的优化序列进行聚类.相似性高于97％的序列归为一个操作分类单元，即一个otu。在聚类过程中去除嵌合体.采用rdpclassifier贝叶斯算法对97％相似水平的otu代表序列进行分类学分析，选用silva数据库(http:/www.arb-silva.de/)中已比对的(16s/18s，ssu)核糖体序列数据进行比对，去杂后生成分类操作单元，分析过程中使用trimmomatic、flash、usearch和rdpclassifier等软件平台。3、菌群多样性分析。根据out聚类分析结果，采用ace、chao、shannon、mothur和simpson指数对菌群多样性进行评估。4、菌群分类学分析。采用mothur软件将otu中全部序列与silva数据库进行比对，找出最相近且可信度达80％以上的种属信息，为了获得每个otu的分类学信息，将97％相似水平下每个otu中的所有序列进行一致性分析，找出同一个otu中的不同序列的最近祖先的种属信息作为该otu的种属信息。
菌群多样性分析一般采用ace和chao指数用来计算菌群的丰度，数值越大表示菌群的丰度越高；而shannon指数和simpson指数用来表示菌群的多样性，shannon值越大，说明群落多样性越高，simpson指数值越大，说明群落多样性越低。
1.4.土壤生物膜中可培养细菌的分离鉴定
1.4.1生物膜中可培养细菌的分离
将从流动装置中取出的玻片用0.9％nacl冲洗两次，刮取琼脂并转移到干净的离心管中，加入0.5ml0.9％nacl溶液，振荡、6000g离心5min，取上清100μl，逐级梯度稀释涂平板，37℃培养3-7天。随机挑取单菌落，分离纯化并用r2b液体培养基扩大培养，试剂盒提dna。
1.4.2扩增16srdna鉴定生物膜中可培养细菌
细菌通用引物正向引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；反向引物1492r：5’-ggttaccttgttaggactt-3’。pcr扩增采用tc-xp-d(杭州博日科技有限公司)热循环仪。反应体系20μl：premixtaq(takarataqtmversion2.0plusdye)10μl；模板2μl；引物各0.5μmol/l；ddh2o7μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环；72℃延伸5min。markerdl5000(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
目的dna测定：将pcr得到的dna通过试剂盒进行切胶回收，纯化后进行测序分析。测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.4.3可培养菌株发育树的绘制
将得到的16srdna序列用dnaman进行拼接，完成拼接后的土壤微生物序列的对比采用ncbi中的blast与genbank中已知的序列进行同源性比较，如果16srdna序列同源性大于97％，则认为属于同一个种。选取属内同源性较高的序列进行遗传距离计算，并用mega7.0软件构建系统进化树。
1.5数据分析
数据采用excel、origin8.0等软件进行统计分析。
2结果与分析
2.1高低产土壤生物膜中细菌多样性分析
分别对高低产土壤1、2、4、7天的生物膜样品构建16srdna基因克隆文库，一共八个细菌克隆文库。除去嵌合体之后，从八个细菌克隆文库中一共获得1381个otu，高产田土壤生物膜第1天、第2天、第4天、第7天的otu个数分别为128、159、189、213，低产田土壤生物膜第1天、第2天、第4天、第7天的otu个数分别为150、145、188、209。克隆文库的覆盖率均达到了99.9％(见表1)，理论上测序数据已经覆盖了样品中的全部序列，可以全面反映生物膜中细菌群落的组成。
供试生物膜样品的多样性指数(shannon指数和simpson指数)用来反映群落的alpha多样性指数，其中shannon指数越大表示群落多样性多高，而simpson指数越高则表示群落多样性越低。h4和l4的shannon指数分别达到3.52和3.62，高于同组中其它天，表现出丰富的多样性组成，h1和l1的shannon指数最低，具体表现为h1<h2<h4<h7，l1<l4<l2<l7。两组生物膜的simpson指数具体表现为：h1>h2>h4>h7,l4>l1>l2>l7。综合两种多样性指数结果两组生物膜样品的多样性分别表现为h1<h2<h4<h7，l1<l4<l2<l7，说明随着时间的变化土壤生物膜的多样性增加。chao指数和ace指数是用来估计群落otu数目的指数，用来反映群落物种丰富度的指数，由表1分析可知，chao指数和ace指数均表现为h1<h2<h4<h7，l1<l4<l2<l7，与shannon指数趋势一致。其中高低产土壤生物膜第七天比第一天的otu分别上涨了66.41％、39.33％，chao指数分别上涨了67.86％，20.67％，shannon指数的分别上涨了54.59％、43.08％，说明高产田土壤生物膜中微生物的演替活动更为剧烈。
表1高低产土壤生物膜中细菌多样性指数
2.2不同时期高低产土壤生物膜中细菌群落的聚类分析
对8个不同时期的高低产土壤生物膜样品细菌群落进行聚类分析，结果如图1所示，h4、h7、l7、l4、l2聚集在一起成为一组，而l1、h1、h2聚集在一起分为另一组，说明这两组组内个体其群落组成差异小、相似度高，而组间距离较远，说明两组组间群落差异性加大。
2.3不同时期高低产土壤生物膜中细菌组成
对不同时期高低产土壤生物膜中的微生物进行鉴定后，做多物种分布图(门水平)，结果显示，8个样品中占据主导地位的是厚壁菌门、拟杆菌门以及变形菌门。对比高产田，低产田生物膜出现了疣微菌门，所占比例较小。结果还显示，厚壁菌门在八个样品中的变化随着时间增加而降低，而拟杆菌门、变形菌门的细菌以及疣微菌门是随着时间的变化而增加的，充分的说明土壤早期生物膜的演替过程。
对不同时期高低产土壤生物膜中的微生物进行鉴定后，做多物种分布图(属水平)，其中高产土壤中占主导的菌依次为芽胞杆菌属、乳球杆菌属、pseudogulbenkiania属、肠球菌属、massilia属、假单胞菌属、黄杆菌属、vogesella属等。低产土壤中占主导的菌依次为芽胞杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属、乳球杆菌属、肠球菌属、massilia属、ideonella属、pseudogulbenkiania属等。
2.4高低产土壤样品生物膜中优势菌随时间变化
对两种土壤生物膜样品中的优势菌进行汇总，如图2所示。由图2可知，高产田土壤生物膜中芽孢菌纲(bacilli)随着时间呈现降低趋势，第一天占据所有菌的82.87％，第七天所占比例最低16.24％，芽孢菌纲由绝对优势菌变为非绝对优势菌，主导地位逐渐被其它的菌所取代。同时降低还有梭菌纲(clostridia)由3.65％降低到0.76％。β-变形菌纲(betaproteobacteria)、α-变形菌纲(alphaproteobacteria)、flavobacteriia纲所占的比例逐渐增加。β-变形菌纲由5.84％到第四天最大59.41％，取代芽孢菌纲成为绝对优势菌。α-变形菌纲所占比例由0.84％增加到5.93％。flavobacteriia纲由0.02％增加到16.12％。γ-变形菌纲所占比例在6.48％-13.25％之间波动变化。
由图3可知，低产田土壤生物膜中芽孢菌纲(bacilli)也随着时间呈现出降低趋势，第一天占据所有菌的77.81％，第四天所占比例最低15.05％，芽孢菌纲由绝对优势菌变为非绝对优势菌，主导地位逐渐被其它的菌所取代。同时降低还有梭菌纲(clostridia)由第一天的3.40％降低到第二天的0.23％，第四天和第七天稍有上升趋势。β-变形菌纲(betaproteobacteria)、α-变形菌纲(alphaproteobacteria)、flavobacteriia纲所占的比例逐渐增加。β-变形菌纲由8.38％到第四天最大32.72％，取代芽孢菌纲成为绝对优势菌。α-变形菌纲所占比例由1.20％增加到10.22％。flavobacteriia纲所占比例由第一天的1.64％增加到第四天42.46％，第七天又突然降低。γ-变形菌纲所占比例在7.24％-27.76％之间波动变化。
就整体而言，早期土壤中芽孢菌纲所占比例逐渐减低，绝对优势地位逐渐被β-变形菌纲、α-变形菌纲所、flavobacteriia纲所取代。
2.5不同样品间的主成分分析
将高通量数据结果进行综合和简化，通过主成分分析的二维排序图可直观的揭示1-7天两组土壤生物膜细菌的演替过程。结果如图4所示，pca结果显示在第1天时两种生物膜的性质接近，2、4、7天逐渐加大。说明两组土壤生物膜初始组成微生物差异不明显，而后期由于两组土壤理化性质本身具有差异，导致原本差异不明显的微生物群落朝着不同方向演替。
2.6可培养细菌的系统进化关系
对分离纯化出来的33株细菌进行16srdna系统进化树分析，结果如图5所示，分离出来的细菌绝大多数来自于变形菌门，以β-变形菌纲为主。其中vogesellasp.最多，占所有菌的24.24％，aquitaleasp.次之，占12.12％，massiliasp.、acinetobactersp.、pseudomonassp.均占据9.09％，其它的菌株所占比例较少。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
actcctacgggaggcagca19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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agagtttgatcctggctcag20
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<212>dna
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