本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种吡咯-2-羧酸的提取方法。
背景技术：
随着有害病菌耐药性问题越来越严重，对新型有效的抗菌类活性物质的开发愈显重要。从陆栖微生物中探索新型活性物质的难度越来越大，相对而言，海洋因其环境多样性和特殊性，成为更具发展前景的探索目标。
海洋来源的细菌能产生各种具有抗菌活性的物质。研究较多的菌种有芽孢杆菌属bacillussp.、弧菌属vibriosp.、假单胞菌属pseudomonassp.、黄杆菌属flavobacteriumsp.等。李厚金等从大亚湾来源的假单胞菌属细菌中分离获得灵菌红素，其在体外能有效抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌)和病原真菌(白色念珠菌、近平滑念珠菌和隐球酵母菌)的生长；tareq等报道了从海洋芽孢杆菌属(bacillussp.109ggc020)中分离得到的4种新型脂肽化合物gageopeptidesa～d，该类化合物对1对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌及铜绿假单胞菌等细菌显示出中等抗菌活性(mic＝8～64μg/ml)。
arenibacter属于拟杆菌门(bacteroidetes)黄杆菌科(flavobacteriaceae)的革兰氏阴性菌，该属细菌目前文献报导全部采集自海洋环境，来源包括海洋底泥、褐藻(chordafilum)、绿藻(ulvafenestrata)以及可食用海参(apostichopusjaponicus)。文献报导arenibacter能够合成多种特殊的糖苷酶，特别是高活性的beta-n-乙酰-氨基葡萄糖苷酶以及alpha-n-乙酰半乳糖苷酶。tonygutierrez等从实验室培养的硅藻(skeletonemacostatum)培养液中分离得到7株arenibacter属菌，发现全部能够降解菲(phenanthrene)，除一株arenibacterlatericiuskctc12957t外，全部能够降解萘(naphthalene)，因此认为降解多环芳烃可以作为该属菌株的鉴别特征之一。高昊等从中国南海底泥来源的一株arenibacter属菌(arenibacternanhaiticussp.nov.nh36at)中分离得到了一系列苯乙胺类化合物，该类化合物具有微弱的抗金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的活性(mic0.50and0.25mg/ml)。
吡咯-2-羧酸(pyrrole-2-carboxylicacid,pca)具有一定的抑菌活性，如对绿脓杆菌和部分植物致病细菌生长的抑制作用，因此其应用前景非常广阔。但现有技术中，从微生物发酵液中提取吡咯-2-羧酸的技术非常有限。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种吡咯-2-羧酸的提取方法，旨在解决现有吡咯-2-羧酸的提取技术非常有限的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种吡咯-2-羧酸的提取方法，包括如下步骤：
将海洋细菌arenibactersp.6a1接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
调节所述发酵液至ph＝3～4，然后进行萃取处理得到萃取物；
将所述萃取物溶解，依次进行凝胶柱层析和hplc分离，得到吡咯-2-羧酸；
其中，所述hplc分离的条件包括：用甲醇/水混合溶剂进行梯度洗脱，检测波长为254nm，收集液相峰的时间为23.05min。
本发明首次从海洋细菌arenibactersp.6a1中分离获得吡咯-2-羧酸，该提取方法先将该细菌用发酵培养基进行大量发酵，然后进行萃取，应用凝胶柱层析和hplc分离等现代色谱学手段对发酵产生的次级代谢产物进行分离纯化，并对得到的活性化合物应用现代波谱学方法和理化性质等确定其化学结构，最终得到高纯度、具有抑菌活性的吡咯-2-羧酸，为吡咯-2-羧酸的工业化生产提供很好的基础。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种吡咯-2-羧酸的提取方法，包括如下步骤：
s01：将海洋细菌arenibactersp.6a1接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
s02：调节所述发酵液至ph＝3～4，然后进行萃取处理得到萃取物；
s03：将所述萃取物溶解，依次进行凝胶柱层析和hplc分离，得到吡咯-2-羧酸；其中，所述hplc分离的条件包括：用甲醇/水混合溶剂进行梯度洗脱，检测波长为254nm，收集液相峰的时间为23.05min。
本发明首次从海洋细菌arenibactersp.6a1中分离获得吡咯-2-羧酸，该提取方法先将该细菌用发酵培养基进行大量发酵，然后在酸性条件下进行萃取，应用凝胶柱层析和hplc分离等现代色谱学手段对发酵产生的次级代谢产物进行分离纯化，并对得到的活性化合物应用现代波谱学方法(ms、nmr、cosy、hsqc、hmbc、noe等)和理化性质等确定其化学结构，最终得到高纯度、具有抑菌活性的吡咯-2-羧酸，为吡咯-2-羧酸的工业化生产提供很好的基础。
本发明实施例提供的海洋细菌为赤潮水样细菌arenibactersp.6a1，采自中国深圳南澳东山码头(已在中国典型培养物保藏中心保存，菌种编号：cctccm2017262)。为了使该菌株arenibactersp.6a1具有更好的活性，提高后续发酵效果，在将所述海洋细菌arenibactersp.6a1接种到发酵培养基之前，先在2216e固体培养基上经复苏处理，即将低温保藏的海洋细菌arenibactersp.6a1平板复苏。2216e固体培养基：为2216e液体培养基(配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏1g/l，磷酸高铁0.01g/l，海盐20g/l)加1.5％琼脂，经121℃高压灭菌20分钟得到。
进一步地，所述发酵培养基为2216e液体培养基，配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏1g/l，磷酸高铁0.01g/l，海盐20g/l)。
进一步地，为了提高吡咯-2-羧酸的产率，需进一步提高发酵效果。本发明实施例中优选的发酵培养的条件为：转速180rpm，温度28℃，时间96h。即该条件下，可得到高含量吡咯-2-羧酸的海洋细菌arenibactersp.6a1的发酵液。
进一步地，在上述步骤s02中，所述萃取处理的步骤包括：以乙酸乙酯为萃取剂，对所述发酵液进行萃取，然后在低于50℃下旋转蒸干，得到乙酸乙酯层的所述萃取物。优选地，所述萃取处理的步骤重复三次，以将发酵液中的目标物质(吡咯-2-羧酸)尽可能地全萃取到。
进一步地，在上述步骤s03中，所述凝胶柱层析为sephadexlh20(羟丙基葡聚糖凝胶，常用商品凝胶的一种)柱层析。sephadexlh20柱层析的步骤包括：将所述萃取物用甲醇溶解，然后以氯仿:甲醇＝1:1为洗脱溶剂进行等梯度洗脱，先后共得8个等体积的馏份：g3-a、g3-b、g3-c、g3-d、g3-e、g3-f、g3-g和g3-h，该8个馏份的极性依次减小。然后将极性最小的馏份g3-h浓缩蒸干，溶于甲醇后，用甲醇/水混合溶剂进行梯度洗脱。其中，梯度洗脱的时间为30min，流速为1ml/min。如此，分离效果最佳。
另一方面，本发明实施例还验证了吡咯-2-羧酸的抑菌活性(五株鲍曼不动杆菌acinetobacterbaumannii、三株绿脓杆菌pseudomonasaeruginosa和两株克雷白氏杆菌klebsiellapneumonia)，说明本发明实施例制备的吡咯-2-羧酸可以用于制备鲍曼不动杆菌抑制剂、绿脓杆菌抑制剂和克雷白氏杆菌抑制剂，而本发明实施例的arenibactersp.6a1的发酵液也可以用于制备鲍曼不动杆菌抑制剂、绿脓杆菌抑制剂和克雷白氏杆菌抑制剂。即本发明实施例还提供了一种吡咯-2-羧酸用于制备鲍曼不动杆菌抑制剂、绿脓杆菌抑制剂和克雷白氏杆菌抑制剂的应用。
本发明报实施例从一株深圳海域赤潮来源细菌arenibactersp.6a1中生产吡咯-2-羧酸，用其对47株临床病菌的抗菌活性筛查结果。发现该化合物在400μg/ml时对试验中用到五株鲍曼不动杆菌、三株绿脓杆菌和两株克雷白氏杆菌均表现出一定抑菌活性。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
arenibactersp.6a1菌种发酵
将低温保藏的海洋细菌arenibactersp.6a1在平板培养基上平板复苏，然后将复苏菌种接种到发酵培养基中，180rpm，28℃培养96小时；
其中，平板培养基为2216e液体培养基(配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏1g/l，磷酸高铁0.01g/l，海盐20g/l)加1.5％琼脂，经121℃高压灭菌20分钟；发酵培养基为2216e液体培养基(配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏1g/l，磷酸高铁0.01g/l，海盐20g/l)。
按照上述方法发酵后，即可得到含有吡咯-2-羧酸的海洋细菌arenibactersp.6a1的发酵液。
实施例2
吡咯-2-羧酸的分离
将实施例1得到的发酵液进行如下步骤：
乙酸乙酯萃取：用1mol/l的盐酸调节发酵液的ph至3～4，用乙酸乙酯萃取，将萃取得到的萃取液在低于50℃下旋转蒸干，重复三次萃取过程，得到乙酸乙酯层的萃取物2g。
凝胶柱层析：将乙酸乙酯层的萃取物溶于2ml甲醇中，进行sephadexlh20(柱子规格：直径＝3.5cm，柱长＝100cm)柱层析，利用400ml体积比为1:1的氯仿和甲醇的混合液作为洗脱溶剂进行等梯度洗脱，每50ml收集为一个馏份，共得8个馏份，g3-a、g3-b、g3-c、g3-d、g3-e、g3-f、g3-g和g3-h。
hplc分离：将g3-h馏份浓缩蒸干，溶于1ml甲醇中，用甲醇/水混合溶剂进行梯度洗脱(洗脱梯度：meoh:h2o＝meoh:h2o＝5:95～80:20,洗脱梯度时间：30min,流速1ml/min)，检测波长254nm，于23.05min时收集液相峰，得目标馏份，干燥，得到化合物：吡咯-2-羧酸(9mg)。(采用的hplc型号为：安捷伦1260；检测器型号：安捷伦1260dad；柱子类别与规格为：ymc-c18,4.6×250mm,5μm)。
对上述hplc分离所得到的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
白色粉末，lc-msm/z112.3[m+h]+，134.4[m+na]+；1hnmr(600mhz，dmso-d6)和13cnmr(600mhz，dmso-d6)数据见下表1化合物的nmr数据(600mhz，dmso-d6，jinhz,δinppm)。
表1
根据以上理化数据可知，此化合物的数据与现有吡咯-2-羧酸数据完全一致。因此鉴定该hplc分离得到的化合物为吡咯-2-羧酸，结构如下所示：
实施例3
吡咯-2-羧酸抗植物致病真菌活性鉴定
通过设置梯度浓度的吡咯-2-羧酸对47株临床致病细菌进行抗菌试验。用dmso将实施例2提取的吡咯-2-羧酸溶解成200μg/μl样品浓度，然后稀释至100μg/μl。将47株临床致病细菌在lb(配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l)平板培养基中复苏(37℃，1d)后，挑取单菌落至装有20mllb培养基的50ml离心管中，180rpm，37℃摇床培养1d；重新配置lb琼脂培养基，待其冷却至40℃左右后接入1％上述细菌菌液，摇匀，倒板，在凝固的平板上放置灭菌后的滤纸片，分别加入2ul前面配制的吡咯-2-羧酸样品至样品终浓度为400μg/ml，200μg/ml，对照组加入2μldmso，每个实验组和对照组分别设置3个重复；将处理好的平板放至37℃培养，1d后观察抑菌圈产生的情况。表2显示两个浓度的样品对47株临床致病细菌的抑菌筛查效果。其中发现，400μg/ml终浓度时吡咯-2-羧酸对试验中用到五株鲍曼不动杆菌、三株绿脓杆菌和两株克雷白氏杆菌均表现出一定抑菌活性(见表2)。
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。