一种包含蒙氏假单胞菌的菌剂在净化含硫气体中的应用的制作方法

文档序号:15457393发布日期:2018-09-15 01:28

本发明属于环境治理领域,具体涉及一种包含蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1的菌剂在净化挥发性有机硫废气中的应用。



背景技术:

农药生产中的废水含有大量的有机硫农药和有机氯农药中间体,成分复杂、浓度高、毒性强。部分有机硫农药和有机氯农药的产品或其中间体如对硫磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、三氯乙醛、三氯化磷等,具有挥发性,并且大多数的有机硫和有机氯农药具有刺鼻的异味。

对硫磷(C10H14NO5PS)是无色油状液体,水中溶解度为24mg/L(25℃)。微溶于石油醚及煤油,可与多数有机溶剂混溶,有蒜臭。在碱性介质中迅速地水解;在中性或微酸性溶液中较为稳定;对紫外光与空气都不稳定。对微生物有致突变性和动物致畸性。属高毒类,具有急性毒性、刺激性、致突变性。200μg/L时影响人体淋巴细胞姐妹染色单体交换;10μmol/L时影响人成纤维细胞程序外DNA合成;10μmol/L时,16小时内使大鼠淋巴细胞DNA损伤,IARC致癌性评价为G3级;大鼠经口最低中毒剂量(TDLo):360μg/kg(孕2~22d/产后15d),影响新生鼠生化和代谢;大鼠皮下最低中毒剂量(TDLo):9800μg/kg(孕7~13d),致死胎。对硫磷能通过消化道、呼吸道及完整的皮肤和粘膜进入人体。环境中的对硫磷也可以通过食物链发生生物富集。

马拉硫磷(C10H19O6PS2)为无色或淡黄色油状液体,有蒜臭味。遇明火、高热可燃;与强氧化剂发生反应;受热分解产生磷、硫的氧化物气体;对动物有毒性,对眼睛、皮肤有刺激性;在pH 5.0以下有活性,pH7.0以上容易水解失效。雌鼠急性经口LD50为1751.5mg/kg,雄大鼠急性经口LD50为1634.5mg/kg,大鼠急性经皮LD50为4000~6150mg/kg。中毒症状为头痛、头晕、恶心、无力、多汗、呕吐、流涎、视力模糊、瞳孔缩小、痉挛、昏迷、肌纤颤、肺水肿等。短期内接触(口服、吸入、皮肤、黏膜)大量有机磷农药后一般发病较快。马拉硫磷中毒的潜伏期较长。经皮肤吸收,在12h内发病,中毒症状表现为食欲减退、恶心、呕吐、腹痛、多汗、事物模糊、瞳孔缩小、呼吸道分泌物增加,支气管痉挛呼吸困难、肺水肿;样症状表现为肌束震颤,肌痉挛、肌麻痹;中枢神经系统症状表现为头痛、头晕、失眠活嗜睡、乏力、烦躁、抽搐、昏迷、脑水肿。口服中毒时病情较重,胃肠道症状更明显。部分病例可有心肌、肝、肾损害。

甲基对硫磷(C8H10NO5PS):无色结晶粉末,工业品为棕色或黄色液体或固体,遇明火、高热可燃,受热分解释放磷、硫的氧化物等毒性气体,在碱液中能迅速分解。对大白鼠急性经口LD50为14~24mg/kg,对兔急性经皮LD50为300~400mg/kg,属高毒级农药。甲基对硫磷具触杀和胃毒作用,能抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活力而致死,杀虫谱广,常加工成乳油或粉剂(见农药剂型)使用,主要用途是防治多种农业害虫。对微生物具有一定的致突变性,如鼠伤寒沙门氏菌667μg/皿;大肠杆菌:10mmol/L。气态、雾态、气溶胶状态或粉状的易为呼吸道吸收,液态可经眼黏膜、皮肤或肠胃道吸收。进入体内后,迅速分布至全身各器官组织,并与组织蛋白牢固结合。

有机氯农药是目前使用最广泛的杀虫剂之一,在农药市场中占有重要的地位。然而,在有机氯农药生产及农药废水处理过程中,具有挥发性的农药产品或中间体,从液相挥发,逸散到空气中,形成空气污染。

易挥发的农药及中间体包括:敌百虫、敌敌畏、三氯化磷、敌草腈、茵草敌、甲拌磷、辛硫磷、联苯、甲氟磷、烷烃及取代烷烃类中间体、芳香族类中间体等(挑有机氯),这些物质大多数具有刺鼻的气味,有些物质如二乙基亚磷酸酯、三氯乙醛,属于致癌性、致突变性和致畸性的三致性物质。

在废水处理过程中,因曝气、推动水流等机械扰动,这些具有异味的有机硫、有机氯从水中逸散到空气中,形成恶臭污染。如果不加以适当的处理,逸散到空气中的有机氯,严重污染环境,危害人体健康。

生物技术因其具有成本低、操作简便、技术清洁、无二次污染等优点,是目前有效处理含有机物废气的重要方法之一。生物处理技术的原理是利用微生物的生物氧化作用将有机硫转化为硫酸盐、二氧化碳、水等无害或低害类物质的过程,如下:

马拉硫磷二氧化碳+硫酸盐+水;

甲基对硫磷→对硝基苯酚+有机硫酸盐→硫酸盐+磷酸盐+二氧化碳+水;

对硫磷→对硝基苯酚+有机硫酸盐→硫酸盐+磷酸盐+二氧化碳+水。

生物处理技术的原理是利用微生物的生物氧化作用将有机氯转化为二氧化碳、盐酸盐和水等无害或低害类物质的过程(式1)。

C2HCl3O+O2→CO2+H2O+HCl(式1)

已有研究表明,自然环境中的兼性化能异养细菌属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)X2(201310551914.2)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium griseoflavus)SCU-B140(201510715812.9)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans),嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)和Ferroplasma acidiphilum的混合培养物(201310745138.X)等均对有机硫农药具有降解作用。但是尚未发现用于处理有机硫和有机氯的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii),以及采用蒙氏假单胞菌处理含硫、含氯污染物的方法。



技术实现要素:

为了解决现有技术中挥发性有机硫、有机氯处理效率低、微生物在混合载体表面负载不均匀、启动慢、长期使用填料出现塌陷的问题,本发明提供一株蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii),并将该菌株应用到脱除含有机硫废气中。

所述的蒙氏假单胞菌,具体为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1,是从含甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷等有机硫和三氯化磷、三氯乙醛等有机氯的农药废水中驯化、分离得到的分离菌。该菌株已于2017年3月10号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.13748,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101。

该菌株特点如下:

蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1:细胞呈杆状,周生鞭毛,革兰氏染色阴性,淀粉水解、VP、吲哚反应为阴性,明胶液化、葡萄糖反应为阳性。菌落为白色,圆形,表面光滑,湿润粘稠,扁平突起。在自然环境中,竞争能力强,适应范围广,可以广泛利用碳水化合物、氨基酸、有机酸为碳源,pH适应范围广(pH 3.0-7.0),在高温(50℃-60℃)件下都可生长,最适生长温度为30-55℃,pH为4.0-6.5。

本发明还提供一种由蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1制备的菌剂,该菌剂可用于净化含有机硫的废气,解决农药废水处理等过程产生的挥发性有机硫的污染问题,所述菌剂的制备方法如下:

(1)发酵液制备方法

蒙氏假单胞菌LW-1经斜面培养后接入发酵培养基中,按10-25%接种量逐级扩大培养,发酵条件:35-45℃,通风量10-100L/min,溶解氧>2.0mg/L,罐压0.03-0.10Mpa条件下,培养时间45-55h;

所述发酵培养基为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH 6.2-7.0,115℃灭菌20min,灭菌后冷却至室温再加入4.5mg/L对硫磷;

(2)液体菌剂制备方法

发酵液置于冷冻离心机中于4℃,2000-8000rpm,离心浓缩5-20min,弃去上清液,沉淀用无菌营养液稀释,获得菌体浓度为0.3-0.95g/L的菌悬液;

将菌悬液包装为液体菌剂形成蒙氏假单胞菌菌剂产品,用于挥发性有机硫废气的处理;

所述无菌营养液为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgCl2 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH 6.2-7.0,115℃灭菌20min。

本发明还提供采用上述菌剂处理含有机硫的方法,具体如下:

将上述液体菌剂负载在填料上,用于处理农药废水储池产生的含有机硫废气,气体流量为100-5000m3/h,停留时间1.0-5.0min,温度35-55℃,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷的总浓度为20-200mg/m3,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷降解效率可以达到90%以上;

所述填料为聚氨酯泡沫块、陶粒、火山岩或分子筛中的一种或多种,填料中蒙氏假单胞菌LW-1菌体浓度1.0×105-9.0×108CFU/g(填料)。

有益效果:

1.本发明的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1具有较高的降解有机硫的效率,可达90-100%;并且优势菌的适应期短,接种1周内可以快速开始降解反应,应用在净化含有机硫的废气生物反应器中,能够缩短启动期。

2.利用沉降、附着和离心等多种力学的作用,将降解蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1菌剂附载在网面空心球内部的轻质多孔材料上,形成微生物活性填料,菌细胞不仅能够均匀地附着在填料表面,而且能够进入填料内部的孔中,使微生物活性填料的菌细胞附载量高,不易从生物反应器中流失。

3.蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。该假单胞菌通过分泌抗生素,抑制其他微生物,含有噬铁素,可分泌的铁载体,在铁的竞争中有明显优势。

4.蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1是化能有机营养型,具有接触酶,能利用和分解挥发性有机硫/有机氯。

5.蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1有抗病毒活性,对TMV(烟草花叶病毒)、PVY(马铃薯Y病毒)等病毒有抑制作用,使用较安全。

附图说明:

图1蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1系统发育树。

具体实施方式:

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本专利进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利,并不用于限定本发明。

菌种鉴定:

DNA提取:采用全自动磁珠核酸提取仪Smart LabAssist-16及相应环境样品DNA提取纯化试剂盒(台湾圆点奈米技术股份有限公司)分别筛选获得的菌株DNA进行提取和纯化,选用细菌通用引物F16S-27和R16S-1492进行PCR扩增,引物序列分别为:

F16S-27(5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`)

R16S-1492(5`-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3`)

PCR反应条件设定为:94℃预变性5min;随后94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,循环25个周期;然后72℃延伸10min;最后4℃保持10min。经过对PCR产物纯化、质检后将PCR纯化产物连接到PMD-18T载体上,随后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的感受态细胞50μL涂布于含有异丙基硫代半乳糖苷、X-gal和氨苄的LB培养基上。37℃恒温培养箱过夜培养,从每个平板挑取25个白色单菌斑进行液体LB培养基培养。培养2小时后,将培养液进行测序分析。测得的序列首先采用DNAMAN软件进行相似性归并,将相似性大于97%的序列归并为一个操作单元,选取每个操作单元中的代表序列利用BLAST与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性分析,选取1400bp以上长度进行比对(Clustelx1.83),采用邻位连接(Neighbour Joining)法进行系统学分析(MEGA3.1),系统发育树如图1所示。经过DNA序列比对,该菌株为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii),命名为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1。

实施例1一种含有蒙氏假单胞菌的菌剂在净化含硫气体中的应用

一种由蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1制备的菌剂,该菌剂可用于净化含有机硫废气,解决农药废水处理等过程产生的挥发性有机硫的污染问题,所述菌剂的制备方法如下:

(1)发酵液制备方法

蒙氏假单胞菌LW-1经斜面培养后接入发酵培养基,按10%接种量逐级扩大培养,发酵条件:35℃,通风量10L/min,溶解氧>2.0mg/L,罐压0.03-0.10Mpa条件下,培养时间55h;

斜面培养基组成为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000ml,琼脂20g,pH值6.2-7.0,115℃灭菌20min;

所述发酵培养基为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH6.2-7.0,115℃灭菌20min,灭菌后冷却至室温再加入4.5mg/L对硫磷;

(2)液体菌剂制备方法

发酵液置于冷冻离心机中于4℃,2000rpm,离心浓缩20min,弃去上清液,沉淀用无菌营养液稀释,获得菌体浓度为0.3g/L的菌悬液;

将菌悬液包装为液体菌剂形成蒙氏假单胞菌菌剂产品,用于挥发性有机硫废气的处理;

所述无菌营养液为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgCl2 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH6.2-7.0,115℃灭菌20min。

采用上述菌剂处理含有机硫废气的方法,具体如下:

将上述液体菌剂负载在聚氨酯泡沫块填料上,填料中蒙氏假单胞菌LW-1菌体浓度1.0×105CFU/g(填料),用于处理农药废水储池产生的含有机硫废气,气体流量为100m3/h,停留时间1.0min,温度35℃,马拉硫磷的浓度为13.2mg/m3、对硫磷的浓度为33.7mg/m3、甲基对硫磷的浓度为8.3mg/m3,马拉硫磷去除率为92.6%、对硫磷降解效率为85.1%、甲基对硫磷降解效率可以达到90.7%。

实施例2一种含有蒙氏假单胞菌的菌剂在净化含硫气体中的应用

一种由蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1制备的菌剂,该菌剂可用于净化含有机硫废气,解决农药废水处理等过程产生的挥发性有机硫的污染问题,所述菌剂的制备方法如下:

(1)发酵液制备方法

蒙氏假单胞菌LW-1经斜面培养后接入液体发酵培养基中,按25%接种量逐级放大培养,发酵条件:45℃,通风量100L/min,溶解氧>2.0mg/L,罐压0.03-0.10Mpa条件下,培养时间45h;

斜面培养基组成为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000ml,琼脂20g,pH值6.2-7.0,115℃灭菌20min;

所述液体发酵培养基为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO4 0.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH 6.2-7.0,115℃灭菌20min,灭菌后冷却至室温再加入4.5mg/L对硫磷;

(2)液体菌剂制备方法

发酵液置于冷冻离心机中于4℃,8000rpm,离心浓缩5min,弃去上清液,沉淀用无菌营养液稀释,获得菌体浓度为0.8g/L的菌悬液;

将菌悬液包装为液体菌剂形成蒙氏假单胞菌菌剂产品,用于挥发性有机硫废气的处理;

所述无菌营养液为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgCl2 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH 6.2-7.0,115℃灭菌20min。

采用上述菌剂处理含有机硫废气的方法,具体如下:

将上述液体菌剂负载在陶粒填料上,填料中蒙氏假单胞菌LW-1菌体浓度9.0×108CFU/g(填料),用于处理农药废水储池产生的含有机硫废气,气体流量为5000m3/h,停留时间5.0min,温度55℃,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷的总浓度为132.5mg/m3,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷降解效率可以达到91.4%。实施例3一种含有蒙氏假单胞菌的菌剂在净化含硫气体中的应用

一种由蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)LW-1制备的菌剂,该菌剂可用于净化含有机硫废气,解决农药废水处理等过程产生的挥发性有机硫的污染问题,所述菌剂的制备方法如下:

(1)发酵液制备方法

蒙氏假单胞菌LW-1经种子培养后,按18%接种量接入发酵培养基中,发酵条件:40℃,通风量50L/min,溶解氧>2.0mg/L,罐压0.03-0.10Mpa条件下,培养时间50h;

斜面培养基组成为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000ml,琼脂20g,pH值6.2-7.0,115℃灭菌20min;

所述发酵培养基为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgSO4 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH 6.2-7.0,115℃灭菌20min,灭菌后冷却至室温再加入4.5mg/L对硫磷;

(2)液体菌剂制备方法

发酵液置于冷冻离心机中于4℃,5000rpm,离心浓缩10min,弃去上清液,沉淀用无菌营养液稀释,获得菌体浓度为0.6g/L的菌悬液;

将菌悬液包装为液体菌剂形成蒙氏假单胞菌菌剂产品,用于挥发性有机硫废气的处理;

所述无菌营养液为:葡萄糖0.5g,K2HPO4 0.5g,KH2PO4 1.5g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 0.5g,MgCl2 0.2g,CaCl2 0.05g,FeSO4 0.02g,水1000mL,pH6.2-7.0,115℃灭菌20min。

采用上述菌剂处理含有机硫废气的方法,具体如下:

将上述液体菌剂负载在火山岩填料上,填料中蒙氏假单胞菌LW-1菌体浓度5.0×107CFU/g(填料),用于处理农药废水储池产生的含有机硫废气,气体流量为2500m3/h,停留时间3.0min,温度45℃,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷的浓度分别为16.3mg/m3,20.8mg/m3和6.5mg/m3,马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷降解效率可以分别达到89.2%,93.6%和92.5%。

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