本发明属于胚胎干细胞分化培养技术领域，尤其是涉及定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的培养基及方法。
背景技术：
大鼠是一种被广泛应用的动物模型，由于它的生理特征较小鼠相比更趋近于人类且具有更好的实验可操作性，所以被广泛应用于心血管、肺部疾病、神经、代谢、免疫、药理学、衰老、癌症等领域的研究。特别是在心脏领域，大鼠的心跳频率较小鼠更接近于人类，所以是一种非常理想的心脏疾病机制研究模型。由于大鼠胚胎干细胞的成功分离使得转基因修饰大鼠胚胎干细胞成为了可能，这为研究疾病机制提供了非常重要的手段。然而大鼠胚胎干细胞体外诱导心肌细胞分化模型的建立一方面需要采用合适的培养基，另一方面需要科学的培养方法，然而目前并没有关于定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法。
中国专利cn104508121b公布了体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，其是通过在体外维持、扩增、培养多能干细胞，在多能干细胞心肌分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞向心肌细胞分化的时期，向培养基中加入可直接或间接激活smad1/5/8信号通路的物质，使干细胞定向分化为心室肌细胞。然而上述方法并不适用于大鼠胚胎干细胞体外分化。
中国专利cn105483080a公布了一种大鼠胚胎干细胞高效培养基，每40ml的大鼠胚胎干细胞高效培养基包括以下成分：dmem/f12培养基20ml、neurobasal培养基20ml、b-巯基乙醇1.65×10-8mol、chir990211.2×10-7mol、pd03259014×10-8mol、n-2添加剂0.2ml、b-27添加剂0.4ml、l-谷氨酰胺2×10-5mol、重组小鼠白血病抑制因子4.14ul。与传统“2i”培养基相比，其将抑制剂pd0325901、chir99021的使用量提升了一倍，并加入了重组小鼠白血病抑制因子，降低了传统“2i”培养基中的β-巯基乙醇浓度。使用传统“2i”培养基需要4-5天才可使大鼠胚胎干细胞长到合适大小及密度，而使用该培养基需要2-3天即可长到相同密度，且单个干细胞克隆要大于使用传统“2i”培养基所培养的大鼠胚胎干细胞。然而该培养基仍然不适用于定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的培养基及方法。
本发明可广泛应用于大鼠胚胎干细胞定向心肌细胞分化机制研究，心脏疾病相关药物筛选，先天性心脏病发病机制研究等科研领域。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：提供定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的培养基，包括cm高效分化培养基，每50mlcm高效分化培养基包括以下成分：
每50mlcm高效分化培养基还包括青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)0.5ml，所述青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为10000u/ml，即10000μg/ml。
其中ascorbicacid容易降解故每次现用现配，避免冻融；
青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为防止细胞污染而加入，对胚胎干细胞分化无明显影响，可根据实际情况决定是否添加。
本发明第一方面：提供定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的培养体系，包括以下培养基：
n2b27培养基：
每40mln2b27培养基包括dmem/f12-n2培养基20ml、neurobasal/b27培养基20ml，55mmβ-巯基乙醇(dpbs配制)72μl，
cm-feeder培养基：
每50mlcm-feeder培养基包括胎牛血清10ml、非必须氨基酸(100x)0.5ml、dmem/f12培养基38.5ml、55mmβ-巯基乙醇(dpbs配制)90μl、200mml-谷氨酰胺0.5ml，
将此培养基按每孔2ml的量加入到提前铺有生长密度为80-90％的胚胎成纤维细胞饲养层细胞上培养24小时，然后收集细胞培养液既为cm-feeder培养基；
cm培养基：
cm-feeder培养基与n2b27培养基1:1体积比混合；
悬滴培养基：
每配制40ml悬滴培养基需要cm培养基40ml、50mmy27632rock1抑制剂8μl、10mmpd0325901mek抑制剂0.4μl、10mmchir-99021gsk3抑制剂3μl；
cm+2i培养基：
每配制40mlcm+2i培养基需要cm培养基40ml、10mmpd0325901mek抑制剂0.4μl、10mmchir-99021gsk3抑制剂3μl；
cm高效分化培养基：
每50mlcm高效分化培养基包括以下成分：imdm培养基40ml、200mml-谷氨酰胺0.5ml、胎牛血清7.52ml、1-硫代甘油0.52μl、5mg/mll-抗坏血酸(ascorbicacid，用h2o配制)0.5ml。
所述dmem/f12-n2培养基包括dmem/f12培养基与n-2添加剂，其中，dmem/f12培养基与n-2添加剂体积比为100:1；
所述neurobasal/b27培养基包括neurobasal培养基、b-27无血清补充剂(
所述n2b27培养基、cm-feeder培养基、cm高效分化培养基中还可以包括青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)，每50mln2b27培养基、cm-feeder培养基、cm高效分化培养基中包括青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为0.5ml，所述青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为10000u/ml，即10000μg/ml。
青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为防止细胞污染而加入，对胚胎干细胞分化无明显影响，可根据实际情况决定是否添加。
本发明第三方面：提供使用上述培养体系定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：
1)大鼠胚胎干细胞培养到60％-80％密度，使用枪头吹打细胞，将吹下的细胞使用0.025％(质量/体积)胰蛋白酶消化为单细胞；
2)通过细胞计数将大鼠胚胎干细胞浓度调为1.5×105/ml-2.5×105/ml(优选2.0×105/ml)，以18μl-22μl(优选20μl)每滴进行悬滴，此时大鼠胚胎干细胞的培养基为悬滴培养基，悬滴2天；
3)使用cm+2i培养基将小鼠源性层粘连蛋白(laminin)进行50倍稀释，提前4小时将层粘连蛋白(laminin)稀释液铺于待培养分化细胞的培养皿内，4小时后吸干层粘连蛋白(laminin)稀释液，向培养皿内加入cm+2i培养基，然后将已悬滴2天的大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)吸入培养皿内，培养24小时；
4)24小时后大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)已贴壁，此时将cm+2i培养基更换为cm高效分化培养基进行分化培养。
注意：将层粘连蛋白(laminin)稀释液铺于待培养分化细胞的培养皿内时，6孔板每孔加500μl层粘连蛋白(laminin)稀释液即可，其它培养皿加入量的多少依次类推，确保层粘连蛋白(laminin)稀释液完全覆盖培养皿。
本发明定向诱导大鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，主要改进有两个方面，一是分化不同时间点加入不同的培养基，特别是cm高效分化培养基，另一个是可以高效诱导大鼠胚胎干细胞定向心肌细胞分化的细胞外基质层粘连蛋白(laminin)。
与现有技术相比，本发明研发了一种体外大鼠胚胎干细胞定向心肌细胞高效分化培养基，在此基础上结合细胞外基质小鼠来源的层粘连蛋白(laminin)共同构成大鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞高效分化系统，可以更好的促使大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)贴附，增殖，定向心肌细胞分化，此培养系统于分化第8天即可分化产生跳动的心肌细胞，与之前大鼠胚胎干细胞分化培养系统相比，第10天即可达到之前分化方法第22天产生的分化细胞数目。通过免疫荧光检测心肌细胞特异性标记蛋白α-actinin的表达发现此分化系统分化第8天产生的心肌细胞已存在成熟心肌细胞所特有的肌丝样结构，故分化第8天就能产生功能成熟的心肌细胞。通过对分化第15天的心肌细胞特异表达基因的mrna表达情况检测发现我们的高效分化系统相比之前的大鼠定向心肌细胞分化系统能显著提升心肌细胞特异基因的表达。总的来说本发明分化效率高，分化周期短，并且分化产生的细胞数目多。
附图说明
图1：本发明大鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化高效分化系统的分化实验步骤。
图2：在不同分化时间点用已报道的大鼠胚胎干细胞分化系统以及本发明的高效分化系统的细胞状态。(比例尺：500μm)
图3：使用高效分化系统分化至第8天细胞的的心肌特异性标记基因α-actinin的表达情况。
图4：已报道的大鼠胚胎干细胞分化系统以及我们研发的高效分化系统细胞分化到第15天时，心肌细胞特异表达基因的mrna表达情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一、分化系统所需培养基配制方法：
1.n2b27培养基配制方法(以配置40mln2b27培养基为例)：
1)配制dmem/f12-n2培养基：
dmem/f12培养基(gibco,11330057)40ml
n-2supplement(gibco,17502-048)0.4ml
2)配制neurobasal/b27培养基：
neurobasal培养基(gibco,21103049)40ml
200mml-谷氨酰胺0.2ml
3)配制n2b27培养基：
其中，青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为防止细胞污染而加入，对胚胎干细胞分化无明显影响，可根据实际情况决定是否添加。
2.cm-feeder培养基配制方法(以配制50mlcm培养基为例)：
其中，青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为防止细胞污染而加入，对胚胎干细胞分化无明显影响，可根据实际情况决定是否添加。
将此培养基按每孔2ml的量加入到提前铺有生长密度为80-90％的胚胎成纤维细胞饲养层细胞上培养24小时，然后收集细胞培养液既为cm-feeder培养基。
3.cm培养基配制方法(以配制40mlcm培养基为例)：
cm-feeder培养基20ml
n2b27培养基20ml
4.悬滴培养基配制方法(以配制40mlcm培养基为例)：
5.cm+2i培养基配制方法(以配制40mlcm培养基为例)：
cm培养基40ml
10mmpd03259010.4μl
10mmchir-990213μl
6.cm高效分化培养基配制方法(以配制50mlcm培养基为例)：
其中，ascorbicacid容易降解故每次现用现配，避免冻融；青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)为防止细胞污染而加入，对胚胎干细胞分化无明显影响，可根据实际情况决定是否添加。
二、分化系统培养细胞具体方法：
1.大鼠胚胎干细胞培养到合适数目，使用枪头轻轻吹打细胞，将吹下的细胞使用0.025％胰蛋白酶消化为单细胞。
2.通过细胞计数将大鼠胚胎干细胞浓度调为2.0×105/ml，以20μl每滴进行悬滴，此时大鼠胚胎干细胞的培养基为悬滴培养基，悬滴2天。
3.使用cm+2i培养基将小鼠源性层粘连蛋白(laminin)进行50倍稀释，提前4小时将层粘连蛋白(laminin)稀释液铺于待培养分化细胞的培养皿内(6孔板每孔加500μl层粘连蛋白(laminin)稀释液即可，其它培养皿加入量的多少依次类推，确保层粘连蛋白(laminin)稀释液完全覆盖培养皿)，4小时后吸干层粘连蛋白(laminin)稀释液，向培养皿内加入cm+2i培养基，然后将已悬滴2天的大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)吸入培养皿内，培养24小时。
4.24小时后大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)已贴壁，此时将cm+2i培养基更换为cm高效分化培养基进行分化培养。
比较例
现有技术中的大鼠胚胎干细胞定向心肌细胞是由以下方法进行分化：
培养基配制：
1)dm培养基：dmem/f12培养基添加10％(体积比)胎牛血清，100μmβ-巯基乙醇，1％(体积比)非必需氨基酸，2mm谷氨酰胺
2)cm培养基:将dm培养基中胎牛血清增加为20％(体积比)，在胚胎成纤维细胞饲养层细胞上培养后收集培养基，将此培养基与n2b27培养基按1:1(体积比)混合。
3)refm培养基：将cm培养基中添加10μmy27632、0.1μmpd0325901,0.75μmchir99021。
4)cm+2i培养基：将cm培养基中添加10μmy27632、0.1μmpd0325901。
分化方法：
1)在大鼠拟胚体悬滴前，使用胰酶消化大鼠胚胎干细胞然后培养在铺有明胶的细胞培养皿中，使用refm培养基培养30-40分钟去除大鼠胚胎干细胞中混杂的胚胎成纤维细胞饲养层细胞。
2)大鼠胚胎干细胞稀释为105/ml的浓度以30μl每滴的量进行悬滴，悬滴2天形成大鼠拟胚体。
3)随后将大鼠拟胚体转移到超低吸附细胞培养皿中培养4天，其中第2-3天的培养基为cm+2i培养基，第3-6天的培养基更换为cm培养基。
4)分化第6天将大鼠拟胚体转移到铺有基质胶(matrigel)的培养皿中，在dm培养基中诱导分化。
在实施例中研发了一种体外大鼠胚胎干细胞定向心肌细胞高效分化培养基，在此基础上结合细胞外基质小鼠来源的层粘连蛋白(laminin)共同构成我们所研发的大鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞高效分化系统，见图1，可以更好的促使大鼠拟胚体(ratembryonicbody，reb)贴附，增殖，定向心肌细胞分化，此培养系统于分化第8天即可分化产生跳动的心肌细胞，与之前大鼠胚胎干细胞分化培养系统相比，第10天即可达到之前分化方法第22天产生的分化细胞数目，见图2。通过免疫荧光检测心肌细胞特异性标记蛋白α-actinin的表达发现此分化系统分化第8天产生的心肌细胞已存在成熟心肌细胞所特有的肌丝样结构，见图3，故分化第8天就能产生功能成熟的心肌细胞。通过对分化第15天的心肌细胞特异表达基因的mrna表达情况检测发现我们的高效分化系统相比之前的大鼠定向心肌细胞分化系统能显著提升心肌细胞特异基因的表达，见图4。总的来说本产品分化效率高，分化周期短，并且分化产生的细胞数目多。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。