本发明涉及蛋白质分离技术领域,具体为一种鸡蛋清过敏原分离方法。
背景技术:
鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中,目前公认蛋清中的主要过敏原有4种,分别为卵白蛋白(45kda),卵类粘蛋白(28kda),卵转铁蛋白(76kda)和溶菌酶(14kda)。过敏原标准品使用方便,然而已经证实很多标准品受到细菌内毒素(lps)污染。lps能够导致th1/th2类细胞因子失衡,因此在建立致敏动物模型或细胞实验时要严格控制过敏原中lps的含量。分离纯化的过敏原可以不受lps污染,是用于致敏模型的好选择。
然而目前报道的分离纯化方法一次只能分离一种过敏原,不能同时对鸡蛋清中主要的四种过敏原进行分离。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服上述背景技术困难,提供一种将鸡蛋清中四种主要过敏原进行分离的方法。
为达到上述目的,采用的技术方案为:一种鸡蛋清过敏原分离方法,其步骤包含:
1)、鸡蛋清处理液配制:新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清,冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后,加入等体积蒸馏水并用1m盐酸调ph至6.0,4℃搅拌3h后,3000g离心10分钟;收集上清液,用1m盐酸调ph到3.8,4℃搅拌3h后再次离心,收集上清液于-20℃冻存备用;
2)、层析柱制备:取ge公司的cm-sepharoseff柱材,蒸馏水置换5-6次除去酒精,按常规装柱1.6cm×20cm,最终柱体积为30ml;
3)、层析分离:用20mmol/l醋酸-醋酸钠ph4.0平衡柱子,至紫外监测仪读数稳定;上样5ml鸡蛋清处理液,控制流速在1.5ml/min,待穿过峰洗出后换上含0~0.2mol/lnacl醋酸-醋酸钠ph4.3洗脱,200min后换成用含0.1~0.2mol/lnacl醋酸-醋酸钠ph5.5洗脱;待315min时第4峰出峰结束,换上含0~0.4mol/lnaclpbs缓冲液ph7.4洗脱,直至出完最后两峰,分离结束;
4)、蛋白纯度检测:将分离所得蛋白收集,取样10μl与10μl上样缓冲液混合后,取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶sds-page胶孔内,电泳后,凝胶经考马斯亮蓝显色进行检测;
5)、蛋白质的浓缩:将收集到的四种蛋白质纯品用peg浓缩,透析后冻干,于-20℃冻存。
所述聚丙烯酰胺凝胶sds-page为12%分离胶,5%浓缩胶。
采用上述方案的有益效果为:这种鸡蛋清过敏原分离方法应用阳离子交换层析法,将鸡蛋清处理后上样,通过洗脱液ph值和盐浓度调整,使四种蛋白质依次洗脱下来,经蛋白纯度检测验证,bca法检测后计算卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶的提取率分别为60.0%、52.1%、29.6%和90.2%。
附图说明
图1为本发明实施例中离子交换层析曲线示意图。
图2为本发明实施例中过敏原蛋白sds-page的分离图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明,但本发明不仅限于下述实施例,可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下,实施情况可能产生种种变化。
一种鸡蛋清过敏原分离方法,其步骤包含:
1.鸡蛋清处理液的制备:新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清,冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后,加入等体积蒸馏水并用1m盐酸调ph至6.0。4℃搅拌3h后,3000g离心10分钟。上清收集后用1m盐酸调ph到3.8,4℃搅拌3h后离心。上清液于-20℃冻存,即为鸡蛋清处理液。
2.层析柱的制备:将ge公司的cm-sepharoseff柱材取出适量,蒸馏水置换5-6次以除去酒精。按常规装柱(1.6cm×20cm),最终柱体积约30ml。
3.层析分离:用20mmol/l醋酸-醋酸钠(ph4.0)平衡柱子,至紫外监测仪读数稳定。上样5ml鸡蛋清处理液。控制流速在1.5ml/min。待穿过峰洗出后换上含0~0.2mol/lnacl醋酸-醋酸钠(ph4.3)洗脱,200min后换成用含0.1~0.2mol/lnacl醋酸-醋酸钠(ph5.5)洗脱。待315min时第4峰出峰结束,换上含0~0.4mol/lnaclpbs缓冲液(ph7.4)洗脱,直至出完最后两峰,分离纯化结束。
4.蛋白纯度检测:将分离所得蛋白收集,取样10μl与10μl上样缓冲液混合后,取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)胶孔内(15%分离胶,5%浓缩胶),电泳后,凝胶经考马斯亮蓝显色。
5.蛋白质的浓缩:将收集到的四种蛋白质纯品(卵转铁蛋白的前一个峰纯度不高,只收集第二个峰)用peg浓缩,透析后冻干。于-20℃冻存。
6.提取率计算:用bca法测定蛋清处理液中以及四种分离纯化蛋白的蛋白质含量,查阅文献,蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶的质量分数分别为54%、12%、11%和3.4%,再结合上样体积和收集的蛋白液体积,计算出四种主要过敏原的提取率分别为60.0%、52.1%、29.6%和90.2%。
如图1,为实施例中离子交换层析曲线示意图。
如图2为实施例中过敏原蛋白sds-page的分离图,右图为浓缩后的溶菌酶和卵转铁蛋白。由于卵类黏蛋白含20%-25%的糖基成分,电泳时分子量显示偏大,条带弥散属正常现象。