一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针的制作方法

本发明涉及一种能应用于细胞溶酶体内hocl检测的罗丹明b类荧光探针，该探针能够检测细胞溶酶体内hocl浓度的变化。

背景技术

hocl是生物体内重要的活性氧之一，在细胞的氧化还原平衡中有重要作用。当病原体侵入生物时，细胞会产生hocl氧化杀死病原体；但细胞内次氯酸浓度过高时，会造成细胞功能异常，从而导致诸多疾病的发生，比如阿尔兹海默症，风湿性关节炎，癌症等。因此，实现细胞内hocl的实时监测，对于生物体hocl异常相关疾病的研究具有重要意义。

相对于传统的分析方法，荧光探针具有灵敏性高、选择性好、响应快、操作简单、对细胞无损伤等优点，利用荧光探针检测hocl的方法得到了快速发展。

许多hocl荧光探针已有文献报道。然而，大部分已经报道的次氯酸荧光探针并不具有细胞器靶向功能，这对研究细胞器水平hocl的相关研究带来困难。

此外，已报道的hocl探针需要在较多有机溶剂体系中才能实现对hocl的检测。而细胞内有机溶剂含量极低，因此，这些探针并不适用与细胞内hocl的测试[shens.l.etal,sens.actuatorsb254(2018)736-741,zhangy.r.etal,sens.actuatorsb240(2017)18-36]。

基于此，发明人以罗丹明b为荧光团，以硫代双酰肼结构为hocl响应基团，合成了一种对hocl具有高灵敏度和高选择性的荧光探针。该探针具有优异的溶解性，可以在几乎为纯缓冲溶液体系中实现对hocl的测定。此外探针结构中含有溶酶体定位基团—吗啉结构，探针可以应用于细胞溶酶体内hocl的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能应用于细胞溶酶体内hocl检测的罗丹明b类荧光探针的制备及应用。

本发明公开了一种能应用于细胞溶酶体内hocl检测的罗丹明b类荧光探针（rl1），其化学结构如下：

本发明所述探针可以用于溶液中hocl的检测，另外，该探针还可以用于细胞溶酶体内hocl变化的检测及细胞成像。

本发明的探针的合成方法，如图1所示。

本发明的探针对hocl具有很好的选择性。如图2所示。

在没有hocl存在时，该探针不发射荧光；当hocl存在的情况下，本法明所述的探针发出592nm的荧光，而且荧光强度随次氯酸浓度的增加而变强，如图3所示。

本发明所述的荧光探针，还可以用于raw264.7细胞内hocl的检测，如图4所示。

本发明所述的探针能够靶向溶酶体，能实现溶酶体内hocl的检测，如图5所示。

附图说明

图1是本发明探针的合成方法。

图2是本发明探针的选择性分析。

图3是本发明探针检测hcol时荧光强度的变化。

图4是本发明探针的响应时间曲线。

图5是本发明探针应用于raw264.7细胞内hocl的检测。

图6是本发明探针靶向溶酶体实验分析。

具体实施方法

实施例1：探针的合成路线见图1。

将化合物1（2mmol）溶于10mlsocl2中，加热回流2个小时后，减压除去溶剂，得固体2（未提纯，直接用于下一步反应）。

将化合物2（2mmol）溶于10ml干燥吡啶中，常温搅拌约1小时，然后将化合物3（1mmol）加入反应体系，常温搅拌12小时。将反应液倒入150ml二氯甲烷中，然后用200ml水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，再进行柱层析分离，得本发明所述探针rl1，白色固体，产率45%。

以¹hnmr、¹³cnmr及hrms对其进行结构，数据如下：

¹hnmr(400mhz,d6-dmso),δ(ppm):1.09(t,12h,j=6.8hz,ch3),2.31(s,4h,ch2),3.30(q,8h,j=6.8hz,ch2),3.46(s,2h,ch2),3.54(t,4h,j=4.0hz,ch2),6.30-6.40(br,4h,arh),6.44(d,2h,j=8.8hz,arh),7.13(d,1h,j=6.8hz,arh),7.32(d,2h,j=8.0hz,arh),7.55-7.70(m,4h,arh),8.01(d,1h,j=6.8hz,arh),10.63(s,1h,arh).

¹³cnmr(100mhz,d6-dmso),δ(ppm):164.1,153.2,148.5,141.8,135.9,132.9,131.3,129.6,128.7,128.4,127.7,124.3,123.7,107.6,103.30,97.0,66.1,61.9,53.1,43.6,12.4.

hrmsm/z:calcdforc40h46n5o3s[m+h]⁺:676.3321;found:676.3317.

实施例2：

配制1μm探针的pbs缓冲溶液（含1%乙醇，ph5.00）。再分别加入下列离子，1:blank,2:na⁺,3:k⁺,4:ca²⁺,5:mg²⁺,6:zn²⁺,7:al³⁺,8:cu²⁺,9:mn²⁺,10:li⁺,11:co²⁺,12:hg²⁺,13:pb²⁺,14:f^-,15:cl^-,16:br^-,17:i^-,18:aco^-,19:no3^-,20:no2^-,21:s2o3^2-,22:hco3^-,23:hpo4^2-,24:hs^-,25:so4^2-,26:asn,27:asp,28:glu,29:gly,30:hcy,31:ser,32:trp,33:cys,34:h2o2,35:t-buooh,36:t-buo•,37:¹o2,38:^-o2,39:•oh,40:hocl。concentration:40µmfor(2)-(39);3µmfor(40)。通过荧光测试发现，只有在hocl存在时，探针在592nm处才有荧光发射，而其他的离子并不能导致探针在592nm处荧光变化，因此本发明所述的探针对次氯酸具有好的选择性，如图2所示。

实施例3：

配制1μm探针的pbs缓冲溶液（含1%乙醇，ph5.00）。分别向上述缓冲溶液中加入0μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm的次氯酸，然后进行荧光光谱分析，结果显示探针在592nm处的荧光发射随着次氯酸浓度的增加而变强，如图3所示，图（a）为探针在不同浓度hocl中荧光发射图，图(b)为探针在592nm处荧光强度与hocl浓度的关系。实验结果表明，探针可以用于溶液中hocl的检测。

实施例4：

配制1μm探针的pbs缓冲溶液（含1%乙醇，ph5.00）。对照组：测试样品在592nm处荧光强度随时间变化变化。实验组：向样品中加入3μmhocl，记录样品在592nm处荧光强度随时间变化变化。实验结果表明，在加入hocl时，探针在很短时间内对hocl做出相应（小于10秒），因此探针具有优异的灵敏性，如图4所示。

实施例5：

在无血清培养基中加入1μm探针，培养raw264.7细胞30分钟；分别用pbs洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，结果见图5（a）上图所示，探针几乎不发出荧光。

先使用1μg/mllps刺激raw264.7细胞6小时，随后再加入1μg/mlpma继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入1μm本发明所述探针rl1，培养30分钟；细胞分别用pbs洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，如图5（a）下图所示，探针发出强烈的荧光。实验结果表明，本发明所述的探针，可以实现raw264.7细胞内hocl的检测。

实施例5：

先用1μg/mllps刺激raw264.7细胞6小时，随后再加入1μg/mlpma继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入本发明所述探针1μm，培养30分钟；再加入溶酶体标记物lysotrackerdeepred继续孵育30分钟。使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集lysotrackerdeepred和本发明探针（rl1）的荧光照片。然后进行叠加分析。图6（a）为本发明探针（rl1）的荧光图像；图6（b）为lysotrackerdeepred的荧光图像；图（c）为（a）、（b）的叠加图；图（d）为亮场图像；共定位系数为0.96。