一种耐热的酯酶编码基因、载体、工程菌及其编码蛋白的用途的制作方法

本发明涉及酯酶编码基因、载体、工程菌及其编码蛋白的用途，特别是涉及耐热的酯酶编码基因、载体、工程菌及其编码蛋白的用途。

背景技术

酯酶(esterases,ec3.1.1.x)属于典型的α/β水解酶超家族，是一大类能够催化酯键水解和形成的酶类。酯酶催化反应具有底物范围广，反应过程中有立体特异性和区域专一性等优点，并且酯酶在催化底物合成和水解时不需要辅助因子，在有机溶剂中稳定性很高，因此酯酶被广泛应用于洗涤剂、食品工业、纺织工业、制药工业、临床诊疗、化妆品、生物柴油、农业和环境治理等领域。工业上对酯酶的需求与日俱增，酯酶已经成为除蛋白酶和淀粉酶之外在全球销售总量位居第三位的酶类，因此寻找适于工业生产的具有优良催化性能的酯酶成为全球研究者们感兴趣的课题。

目前，变铅青链霉菌(streptomyceslividans)全基因组序列已被测序，从已公布的数据库中寻找酯酶的编码基因并对其进行异源表达及酶学性质研究，以获得有价值的酯酶成为获取该酶的有效途径。但由于酯酶是一类对细胞有毒性的物质，在异源宿主表达时常会对宿主细胞造成毒性导致细胞的裂解，酯酶蛋白在折叠过程中常需要分子伴侣帮助其折叠成正确的构象，酯酶基因密码子的差异以及不同表达系统重组酯酶的糖基化等都会影响酯酶基因的异源表达，因此目前仅有少数酯酶基因在异源宿主中获得较好表达。

变铅青链霉菌(streptomyceslividands)tk24全基因组(completegenome)核苷酸序列在genbank数据库，登录号(accessionnumber)为cp009124。本发明所研究基因为染色体(nz_cp009124)上的基因座(locustag)sliv_14630，在染色体上的核苷酸序列起始位点(start)为3329632，终止位点(stop)为3330888，在genbank中的蛋白质登录号(accession)为aij13909。该段序列全长1257bp，编码418aa，起始密码子(initiationcodon)为tca，终止密码子(stopcodon)为cac，a碱基153个，占比12.2％；t碱基159个，占比12.6％；c碱基482个，占比38.3％；g碱基463个，占比36.8％；gc含量为75.2％，体现了链霉菌基因组的高gc含量特征。由于该基因特定的碱基组成及高的gc含量在大肠杆菌中无法获得异源表达，也为该酶在工业中的应用造成了障碍。

技术实现要素：

本发明所要解决的第1个技术问题是能够在大肠杆菌中进行表达的一种耐热的酯酶编码基因。

本发明所要解决的第2个技术问题是含有上述编码基因的载体。

本发明所要解决的第3个技术问题是含有上述编码基因的工程菌。

本发明所要解决的第4个技术问题是含有上述编码基因的所编码蛋白的用途。

本发明解决第1个技术问题的技术方案为，一种耐热的酯酶编码基因，所述的基因具有seqidno:1所示的碱基序列。

本发明将基因座(locustag)sliv_14630编码酯酶基因命名为estb，本发明的酯酶编码基因命名为estb'，由于estb及estb'所编码蛋白质的氨基酸组成相同，故将其编码的蛋白质统一命名为estb。

本发明所述的含有上述编码基因的载体，通过以下方法制备：将estb'与pet28b质粒连接，构建具卡那霉素kan抗性的重组表达载体pet28b-estb'。

本发明所述的含有上述编码基因的工程菌，通过以下方法制备：

将estb'与pet28b质粒连接，构建具卡那霉素kan抗性的重组表达载体pet28b-estb'；

再将该重组表达载体pet28b-estb'转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于estb'表达的基因工程菌rosetta(de3)plyss/pet28b-estb'，该重组工程菌同时具备卡那霉素kan和氯霉素cam抗性。

所述的编码基因所编码的蛋白在洗涤剂、食品工业、纺织工业、制药工业、农业和环境治理领域的应用。

由工程菌所制的estb最适反应温度为55℃，最适反应ph是9.0，具有高度热稳定性，100℃下放置6h残余酶活在60％以上；以pnpb为底物，estb在25℃，ph9.0条件下比活力为2229.9u/mg；1mm的mn²⁺对酶有强的激活效应，可使酶活提高至145.7％，去垢剂tween-80对estb的酶活有高效的激活作用，0.1％和1％的tween-80可分别使酶活性性提高63.3％和39.6％。

本发明与现有技术相比，所述的基因在保障所编码蛋白质不变的前提下，对1257个核苷酸中的937个核苷酸进行了替换，起始密码子atg，终止密码子taa；a碱基248个，占比19.7％；t碱基328个，占比26.1％；c碱基299个，占比23.8％；g碱基382个，占比30.4％，gc含量也由菌株中的原始核苷酸占比的75.2％下降至54.2％，并且在密码子偏好性方面更利于该编码基因在大肠杆菌中的异源表达。

所制的基因工程菌rosetta(de3)plyss/pet28b-estb'在16-30℃和0.01-0.1mmiptg条件下，在大肠杆菌中成功获得异源表达。

附图说明

图1实施例2所制的estb的ph值与相对活力示意图。

■na-citrate(ph6.0–7.0)；●tris–hcl(7.0–9.0)；▲kh2po4^–naoh(9.0–10.5)。

图2实施例2所制的estb的温度与相对活力示意图。

图3实施例2所制的estb在55℃下的热稳定性示意图。

图4实施例2所制的estb在100℃下的热稳定性示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：表达质粒及表达工程菌的构建

a、将seqidno:1所示的碱基序列estb'交由金斯瑞生物科技公司合成；

b、将seqidno:1所示的碱基序列estb'与载体pet28b连接，构建具有kan抗性的表达质粒pet28b-estb'；即将基因estb'序列和载体pet-28b(+)分别进行ndei和xhoi对应酶切，酶切条件为37℃，反应6h。将双酶切的基因estb'与载体pet-28b(+)进行连接，构建表达质粒pet28b-estb'，连接条件为16℃反应过夜。

c、取出冻存的大肠杆菌感受态细胞rosetta(de3)，冰浴复苏，10min，直至融化取100μl复苏后的细胞，加入到含10μl质粒pet28b-estb'的ep管中，轻旋混匀内容物，冰浴30min，中间轻摇数次，防止菌体沉淀；42℃热休克90s，避免摇动；冰浴5min；加500μllb培养液，摇床37℃振荡培养1～2h，得到转化的菌体；吸取转化的菌体100μl，涂布于含有卡那霉素kan和氯霉素cam抗性的lb固体平板上，待平板表面的菌液被吸收后，放入37℃恒温培养箱倒置培养过夜。平板上长出的菌落即为具kan和cam双重抗性的重组工程菌rosetta(de3)plyss/pet28b-estb'。

实施例2：estb的表达和纯化

挑取实施例1所制的重组工程菌rosetta(de3)plyss/pet28b-estb'于含kan和cam抗性的5mllb液体培养基的试管中，37℃，225rpm，过夜扩大培养；培养物以1:100接种于含50mllb液体培养基的锥形瓶中，37℃，225rpm，振荡培养至od600为0.6时；加入0.01-0.1mm异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，iptg)，16℃诱导表达24h；4℃，5,000rpm，离心5min，收集菌体，超声波破碎；用co²⁺离子亲和柱纯化，并对纯化蛋白进行蛋白质浓度检测，以牛血清蛋白为标准，纯化后的酯酶蛋白浓度为0.786mg/ml。依据酯酶estb的氨基酸组成，该蛋白质共有418个氨基酸组成，分子量(molecularweight)为43.79kda，等电点(isoelectricpoint)为5.92，脂肪族氨基酸指数(aliphaticindex)为92.97％。

实施例3：estb酶活检测的标准体系

estb酶活检测标准体系为1ml，980μl50mmtris-hcl(ph9.0)，10μl0.5mm的对硝基苯酚丁酸酯，10μl纯酶液，使用可以自动控温的cary300uv分光光度计，检测波长为410nm。反应温度25℃，反应时间5min。

实施例4：estb最适ph值试验

除在相应的ph范围使用对应的缓冲液：ph6.0-7.0，50mmsodiumcitratebuffer；ph7.0-9.0，50mmtris-hclbuffer；ph9.0-10.5，50mmk2hpo4-naohbuffer，外，其余与标准条件相同，试验独立重复3次，结果如图1所示，estb的最适ph是9.0。

实施例5：estb最适温度试验

除设置反应温度(10℃-60℃)，外，其余与标准条件相同，试验独立重复3次，取平均值。结果如图2所示，表明该酶的最适温度是55℃。

实施例6：estb热稳定性检测

将实施例2所制的estb蛋白在55℃和100℃分别温育一定时间，采用标准检测体系，25℃检测残余酶活，确定热稳定性，以未处理的纯酶活性设为100％。结果如图3所示，该酶在55℃条件下放置175h酶活性仍无明显变化，100℃下estb放置6h残余酶活在60％以上，8h后酶活仍在30％以上，表明该酶具极强的热稳定性。

实施例7：estb最适底物测定

采用标准的测定体系，测定相同浓度不同链长(c4-c16)对硝基苯酚酯类底物的比活力。一个酶活单位(u)的定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量，重组酶活通过对硝基苯酚标准曲线计算得出。酶的比活力(u/mg)指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，。结果如表1所示：当底物为对硝基苯酚丁酸酯酶的比活力最高，达2229.9u/mg。

表1酯酶estb的比活力

实施例8：estb酶活受金属离子、edta和pmsf(苯甲基磺酰氟)的影响。

采用标准测定体系，分别添加金属离子、edta和pmsf检测estb酶活力，所用缓冲液终浓度为50mmtris-hcl，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表2：

表2estb活受金属离子、edta和pmsf的影响

如表2所示：1mm的mn²⁺对酶最强的激活效应，可使酶活提高至145.7％，随mn²⁺浓度增加，10mm的mn²⁺对酶的激活作用略有降低，仍可使酶活提高至131.9％；在所有被检测的金属离子中，大多数金属离子随其浓度增加酶活性降低，但fe³⁺、k⁺、na⁺、ca²⁺当其浓度从1mm增至10mm时，酶活性有一定程度的增加，mg²⁺随其浓度增加酶活无明显影响；10mm的ni²⁺对酶的抑制作用最强，可使酶活性降低至11.6％；1mm及10mmedta对estb催化活性无明显影响；pmsf对酯酶有一定程度的抑制作用，1mm及10mm的pmsf可分别使酶活降低至65.2％和55.0％。

实施例9：estb酶活受有机溶剂的影响。

采用标准测定体系，分别检测不同有机试剂对酶活的影响，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表3：

表3estb活性受有机溶剂的影响

所有被检测的有机溶剂均对酯酶estb的酶活产生抑制作用，且随含量增加对酶活性的抑制作用增强。含量为15％的乙醇对酶活的抑制作用最小，仅降低至93.7％；酯酶estb对甲醇、二甲基甲酰胺、异丙醇也具一定的耐受作用，该三种有机溶剂体积占比15％时，estb的酶活仍可保持在80％以上。

实施例10：estb酶活受去垢剂的影响。

采用标准测定体系，分别检测不同去垢剂对酶活性的影响，以不加化学试剂的酶活力设为100％，实验独立重复3次，其结果如表4：

表4estb活性受去垢剂的影响

ctab为十六烷基三甲基溴化铵。

tween-80对estb的酶活有高效的激活作用，0.1％和1％的tween-80分别可使酶活性性提高63.3％和39.6％。0.1％的tween-20可使酶活提高12.8％，0.1％的span-20和sds对酶活无明显影响，0.1％的tritonx-100和ctab对酶活有一定程度的抑制作用；随着去垢剂浓度的提高，当体积比提高至1％时酶的活性均有所降低，其中ctab和sds对酶的抑制作用最强，均可使酶活下降至30％。

sequencelisting

<110>安徽师范大学

<120>一种耐热的酯酶编码基因、载体、工程菌及其编码蛋白的用途

<130>2018.05.29

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<213>变铅青链霉菌（streptomyceslividans）

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