检测畜类源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及检测方法与流程

文档序号:15457579发布日期:2018-09-15 01:33

本发明属于基因检测技术领域,特别涉及检测畜类源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及检测方法。



背景技术:

当前,动物产品的掺假现象频繁发生,国内外屡有此类报道,例如在2013年,欧盟不少国家发生了以马肉冒充牛肉的牛肉食品掺假事件。近年来,我国也持续曝光了很多动物产品的掺假事件,包括各地食药监、质检、工商所查获和新闻媒体公布的各类案例:以鸭肉冒充羊肉,以猪肉、鸡肉冒充牛肉,以猫肉冒充兔肉等造假手段。

家牛、水牛、牦牛,绵羊、山羊、羚羊等种属之间,产品特征极其相似、而价格差距却较大。不少市售的特色肉类食品,以水牛、牦牛、绵羊、山羊源性成分作为原料并作为产品卖点,可消费者在消费和食用过程中,基本无法通过感官品评辨别其源性成分。此外,牦牛、羚羊还涉及珍稀野生动物的监管保护、特色经济畜类的人工饲养等事宜。

在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中,通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因,是目前主流的科学依据和技术手段,近年来得到广泛的应用。该技术主要分为两个部分:①提取样品DNA;②DNA的PCR检测。

畜类产品的DNA的提取,从操作方式可分为自动化提取,如尚未普及的自检工作站;半自动化提取,如已逐渐普及的核酸提取仪;手动提取,如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。未加工和粗加工食品的DNA损失小且较完整,上述三种方法均可适用,通常DNA纯度OD260/OD280为1.6至1.8,浓度在ng/μL级,可略作稀释或直接用于PCR检测。

目前重点和难点在于深加工畜类产品,如煎炸食品、炼制食品等。这些样品的DNA破坏程度极大,如果按照核酸提取仪或提取试剂盒的取样量进行提取,通常为1g以下,几乎无法获取到能达到检出限的DNA量;如果将取样量增大至10g以上,又会因为无法适用核酸提取仪或提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。目前,各检测单位通常采用增大取样量,用自制试剂进行手动提取的方法来获取DNA,这些方法种类广泛、区别很大,效果也参差不齐。

第一代PCR技术,通常称为普通PCR技术,先设计物种特异基因的引物,再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增,然后通过电泳对扩增产物进行鉴定,从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR,通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外,再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增,探针的荧光信号累积与基因扩增同步,相对普通PCR,既提升了扩增时的特异性,扩增结束后也立即获得检测结果。