本发明属于基因检测技术领域，特别涉及检测畜类源性成分的三重荧光pcr引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
当前，动物产品的掺假现象频繁发生，国内外屡有此类报道，例如在2013年，欧盟不少国家发生了以马肉冒充牛肉的牛肉食品掺假事件。近年来，我国也持续曝光了很多动物产品的掺假事件，包括各地食药监、质检、工商所查获和新闻媒体公布的各类案例：以鸭肉冒充羊肉，以猪肉、鸡肉冒充牛肉，以猫肉冒充兔肉等造假手段。
家牛、水牛、牦牛，绵羊、山羊、羚羊等种属之间，产品特征极其相似、而价格差距却较大。不少市售的特色肉类食品，以水牛、牦牛、绵羊、山羊源性成分作为原料并作为产品卖点，可消费者在消费和食用过程中，基本无法通过感官品评辨别其源性成分。此外，牦牛、羚羊还涉及珍稀野生动物的监管保护、特色经济畜类的人工饲养等事宜。
在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过pcr技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。该技术主要分为两个部分：①提取样品dna；②dna的pcr检测。
畜类产品的dna的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。未加工和粗加工食品的dna损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常dna纯度od260/od280为1.6至1.8，浓度在ng/μl级，可略作稀释或直接用于pcr检测。
目前重点和难点在于深加工畜类产品，如煎炸食品、炼制食品等。这些样品的dna破坏程度极大，如果按照核酸提取仪或提取试剂盒的取样量进行提取，通常为1g以下，几乎无法获取到能达到检出限的dna量；如果将取样量增大至10g以上，又会因为无法适用核酸提取仪或提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。目前，各检测单位通常采用增大取样量，用自制试剂进行手动提取的方法来获取dna，这些方法种类广泛、区别很大，效果也参差不齐。
第一代pcr技术，通常称为普通pcr技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品dna和引物及扩增试剂混匀后通过pcr仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。
第二代pcr技术为实时定量荧光pcr，通常简称荧光pcr。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光pcr仪(通常简称荧光pcr仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通pcr，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。
多重实时定量荧光pcr(以下简称多重荧光pcr)属于荧光pcr的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光pcr仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光pcr，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。
现有技术公开了涉及动物源性成分鉴定的多重荧光pcr方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的taqman-lna多重荧光定量pcr方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光pcr检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光pcr检测方法》等，但上述方法均未涉及如何通过技术手段区别家牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、羚羊这6个种属。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明针对家牛(bostaurus)、水牛(bubalusbubalis)、牦牛(bosgrunniens)、绵羊(ovisaries)、山羊(capraaegagrus)、羚羊(saigatatarica)这六种我国大型牛、羊的基因组设置特异性的引物探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对家牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、羚羊源性成分的准确检测，绵羊、山羊的通用引物对不使用兼并碱基，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于不同品系畜类源性的充分检出。同时，本发明针对在畜源性荧光pcr检测中，深加工畜类产品dna提取效率低、质量差的问题，优化了样品的前处理方法，具有提取效率较高、提取质量较好的特点，可以满足现有dna提取方法或提取试剂盒的要求，在后续荧光pcr检测中，其ct值基本能达25–35，处于大多数标准无需复检的阈值期间。
在深加工畜类食品，如煎炸食品、炼制食品等的dna提取过程中难点较多。首先，样品dna破坏程度极大，如果按照核酸提取仪或提取试剂盒的取样量进行提取，通常为1g以下，几乎无法获取到能达到检出限的dna量；如果将取样量增大至10g以上，又会因为无法适用核酸提取仪或提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。本方法首先用正己烷将样品表面清洗干净后60℃烘干，洗净样品量可根据实际需要或经验预判在20至200g范围内自行选择，保证了足量的样品dna含量。
其次，深加工畜类食品的样品形态通常呈块、条、粉状，其中细胞各组分通常已成匀质状态，并含有大量不可消化或难于降解的碳化成分或惰性成分。这些碳化或惰性成分通常以大量的颗粒、粉末、沉淀等形式存在，在dna提取过程中，dna溶液通常会被吸附其上，即便通过离心，也会在离心后数秒内被颗粒/粉末/沉淀快速大量地吸收而无法有效分离。本方法通过加入等体积3dh2o在摇床上37℃、200rpm过夜萃取，保证将样品dna尽量溶解至水相；然后通过手动或电动的压榨机分离出绝大部分液相，避免了离心手段无法有效分离的缺点。最后10000rpm、10min离心分离得到其中水相，通过真空浓缩仪浓缩至1ml以下，可适用常规的人工方法、商品化试剂盒、dna提取仪等进行dna提纯。
设计家牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。家牛bo.taurusdomestica、山羊c.aegagrushircus分别是野牛bo.taurus、野山羊c.aegagrus的驯化种；水牛bu.bubalis、牦牛bo.grunniens、绵羊o.aries的驯化种与原种无学名区别。据分子分类学相关研究，高等物种在野生亚种之间，基因差异就已非常小，通常只有个别基因差异，尤其是驯化亚种，基因组几乎与原野生种无区别。且在各基因组文库中，相关序列的物种来源备注，一般只到属、种；精确到亚种、变种、血清型、突变株的，多为某些致病菌、病毒。因此，本发明在检索目的基因时，以bo.taurus、bu.bubalis、bo.grunniens、o.aries、c.aegagrus相关序列为参考依据，不区分原种与驯化种。
设计羚羊的特异性引物和探针时，首先明确其分类学地位。据文献报道，在分类学上，羚羊并没有特定的专指哪个科或属；羚羊类的动物总共有86种，分属于11个族、32个属。在这些属、种中，大多为珍稀、野生物种；本发明选择具有显著药用价值，且存在严格监控保护的塞加羚羊s.tatarica作为鉴定对象。
检索ncbi的genbank后获得bo.taurus、bu.bubalis、bo.grunniens、o.aries、c.aegagrus、s.tatarica的线粒体相关序列数十条，首先用lasergenev7.1.0中的megalign软件比对出保守序列，再通过oligov7.0.1和ncbi的primer-blast验算后进行筛选，发明人发现根据其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)基因的特定位点可设计bo.taurus、bu.bubalis一对通用引物、两条特异探针，o.aries、c.aegagrus一对通用引物、两条特异探针，bo.grunniens专属引物及特异探针，s.tatarica专属引物及特异探针。上述探针分别选用nfq-mgb荧光淬灭基团，相对tamra、bhq等能更有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增。
本发明提供的引物和探针与现行方法相比，sn/t4397-2015《出口食品中牦牛源性成分的检测方法实时荧光pcr法》中探针为34bp，本发明中探针仅20-22bp，降低了序列中段发生非特异性匹配的概率；与sn/t2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时pcr法》相比，本发明细化了牛、羊分类，更贴近日常生活和实际检测；与sn/t2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光pcr检测方法》相比，绵羊、山羊的通用引物对不使用兼并碱基，提升了特异性；与sn/t3730.7-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分水牛成分检测实时荧pcr法》及sn/t2051-2008、sn/t3730.7-2013、sn/t4397-2015相比，本发明提供的检测方法解决了深加工样品的检测问题，操作更加简便。
bo.taurus、bu.bubalis、bo.grunniens、o.aries、c.aegagrus、s.tatarica的引物探针组检测位点举例如下：
(1)bo.taurus的gapdh基因，检测位点如ncbi中nc007303.6序列上的2437bp至2510bp。
(2)bu.bubalis的gapdh基因，检测位点如ncbi中nw005785176.1序列上的2416bp至2490bp。
(3)bo.grunniens的gapdh基因，检测位点如ncbi中eu195062.1序列上的102bp至191bp。
(4)o.aries的线粒体基因，检测位点如ncbi中kf469290.1序列上的146bp至269bp。
(5)c.aegagrus的线粒体基因，检测位点如ncbi中gq240309.1序列上的775bp至880bp。
(6)s.tatarica的线粒体基因，检测位点如ncbi中ky829450.1序列上的6484bp至6585bp。
本发明提供的检测六种畜源性成分的三重荧光pcr引物探针组包括针对bo.taurus、bu.bubalis、bo.grunniens的三重引物探针组a，针对o.aries、c.aegagrus、s.tatarica的三重引物探针组b，具体如表1所示。优选地，既可选择三重引物探针组a、三重引物探针组b同步检测以提升效率，也可根据样品实际检测需要，单独选择使用三重引物探针组a或三重引物探针组b进行鉴定以节省操作和试剂。
表1
本发明还提供检测六种畜源性成分的三重荧光pcr试剂盒，包括上述的引物探针组、荧光pcr试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照。在配套试剂选择上，对于多重荧光pcr试剂，选择带热敏taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；所述荧光pcr试剂中包括rox染料，对于需要rox染料的多重荧光pcr仪可提升检测准确性。更优选地，所述空白对照为3dh2o。
优选地，所述bo.taurus和bu.bubalis通用上游引物、下游引物的浓度分别为20μmol/l，o.aries和c.aegagrus通用上游引物、下游引物的浓度分别为20μmol/l；所述bo.grunniens上游引物、bo.grunniens下游引物、s.tatarica上游引物、s.tatarica下游引物的浓度分别为10μmol/l，表1所述6条探针浓度均为10μmol/l。优选地，所述阳性对照为用上述引物探针组中包含的引物组进行扩增，并用上述引物探针组中包含的探针组检测呈阳性的混合dna片段或基因组，浓度为105copies/μl级。
优选地，所述阴性对照为非畜源性dna，所述空白对照为超纯水。
此外，本发明还提供检测六种畜源性成分的三重荧光pcr方法，包括如下步骤：1)进行样品前处理，提取样品dna；2)建立包括权利要求1或2所述引物探针组的多重荧光pcr反应体系，反应条件为：95℃20s–2min或10–15min；95℃5s–1min，60℃20s–2min；40cycle并收集荧光信号，进行检测结果的判断。当为生物热敏抗体时，95℃20s–2min或10–15min；当为化学热敏抗体时，95℃10–15min。
优选地，所述样品为深加工畜类食品，所述样品前处理包括：用正己烷将样品表面清洗干净后60℃烘干，加入等体积3dh2o在摇床上37℃、200rpm过夜萃取，通过压榨机分离出液相后，10000rpm、10min离心分离得到其中水相，通过真空浓缩仪浓缩至1ml以下。
优选地，所述检测结果的判断方法包括：
①质控标准：阳性对照的三重引物探针组a和三重引物探针组b的pcr反应体系中，fam、vic、ned均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且ct值≥40.0，进行②的畜源性成分检测结果的判断；
②检测结果：样品的三重引物探针组a的pcr反应体系中，fam和/或vic和/或ned有荧光对数增长，且ct值≤30.0时，则含有相应的家牛和/或水牛和/或牦牛源性成分；样品的三重引物探针组b的pcr反应体系中，fam和/或vic和/或ned有荧光对数增长，且ct值≤30.0时，则含有相应的绵羊和/或山羊和/或羚羊源性成分；若上述一种或几种荧光无信号及对数增长，则不含相应的畜源性成分；若30.0<ct值<40.0时，增加模板量复检，如果ct值≥40.0，则检测结果为阴性，如果ct值<40.0，则检测结果为阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对家牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、羚羊特异性基因设置引物探针组，各引物探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，特异性好，检测灵敏度高。
(2)本发明提供的检测方法有利于不同品系畜类源性的充分检出，相对多重pcr方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为105级时，定量标准误差在104级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μl级)的优点；相对荧光pcr方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通pcr方法，兼具上述两种优点。
(3)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于本单位的日常检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间70％以上、节约试剂成本70％以上，具有较好的实用价值。
附图说明
图1本发明实施例三的检测结果图；其中，1-6为初检的阳性对照，15-26为初检的阴性对照和空白对照；7-12为复检的阳性对照，27-38为复检的阴性对照和空白对照，13为初检的家牛源性荧光信号，14为复检的家牛源性荧光信号。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。
实施例一检测六种畜源性成分的三重荧光pcr试剂盒的构建及验证
①引物探针组：如表1所示，可通过具有引物和探针合成能力的公司合成，本实施例选择上海生工生物工程技术服务有限公司合成，将引物和探针干粉稀释至100μmol/l作为储备液，按照表2配制成10μmol/l作为使用液，并用黑色1.5ml离心管在-20℃储存。
表2100μmol/l储备液配制为10μmol/l使用液
②荧光pcr试剂：常见市售样品荧光pcr试剂，本实施例选择abi
③阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/l。提取6种畜类dna标准品，用对应引物和普通pcr试剂在普通pcr仪上进行扩增，将目的条带切胶回收后转入takarat-vectorpmdtm20载体，用感受态e.coli细胞jm109复制，提取pmt-20质粒，分别稀释至106copies/μl级浓度，各取10μl混匀后用3dh2o定容至100μl，终浓度即为105copies/μl级。
④阴性对照：非畜源性dna。
⑤空白对照：超纯水。
⑥多通道荧光pcr仪选用abiquantstudio5，验证样品特征如表3、按表4进行反应液配制、按表5进行反应。
表3样品特征
表430μl反应体系(单位：μl)
表5反应条件
注*：检测荧光信号。
⑦反应结果如表6所示：
表6样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线
⑧验证结果：将试剂盒送至省内同行业检测单位的微生物(含分子生物学)检测实验室，结果一致。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。
实施例二个人委托检测样品——豉汁凤爪、麻辣鸭脖、烧鹅、卤牛肉、水牛奶、牦牛肉干、肥羊卷、羊肉片、羚羊角粉的检测
调取个人委托检测样品豉汁凤爪、麻辣鸭脖、烧鹅、卤牛肉、水牛奶、牦牛肉干、肥羊卷、羊肉片、羚羊角粉，分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9样品。将固态样品球磨粉碎、液态样品直接取样，使用外购dna提取试剂盒(qiagenmagattracthmwdnakit)在小型磁力架(qiagenmagattractmagneticrack)上提取样品dna，均用3dh2o稀释(或真空浓缩)至50ng/μl浓度，引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光pcr试剂为
检测结果见表7：①质控标准：阳性对照的体系a和体系b的fam、vic、ned均有荧光对数增长，且ct值≤30.0；阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且ct值≥40.0。②体系a中#4的fam、#5的vic、#6的ned和体系b中#7的fam、#8的vic、#9的ned有荧光信号和对数增长且ct值≤30.0，其他无荧光信号和对数增长且ct值≥40.0，表明卤牛肉、水牛奶、牦牛肉干、肥羊卷、羊肉片、羚羊角粉分别含有家牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、羚羊源性成分，其他样品不含上述源性成分。③比对结果：与按照或参照sn/t2980-2011、sn/t3730.7-2013、sn/t4397-2015等标准对样品进行相关源性成分检测的结果相符。
表7样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线
实施例三企业委托检测样品——灯影牛肉丝的检测
调取企业委托检测样品，灯影牛肉丝1份，样品量200g，设为10#样品，用正己烷将样品表面清洗干净后60℃烘干，加入等体积3dh2o在摇床上37℃、200rpm过夜萃取，通过电动压榨机分离出液相后，10000rpm、10min离心分离得到其中水相，通过真空浓缩仪浓缩至1ml，通过核酸纯化试剂盒(beckmanagencourtampurexp)在小型磁力架(agencourtspristand6positiontubemagnet)上纯化浓缩至50μl。外购的荧光pcr试剂选择环境样品优化试剂abitaqmantmenvironmentalmastermix2.0，dna提取液上样量选择5μl。引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，上机检测(abi荧光pcr仪，型号为quantstudio5)。
检测结果见图1和表8：①质控标准：阳性对照的体系a和体系b的fam、vic、ned均有荧光对数增长，且ct值≤30.0；阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且ct值≥40.0。②体系a中#10的fam的30.0<ct值<40.0，其他无荧光信号和对数增长且ct值≥40.0；增加dna提取液上样量至10μl复检后ct值<40.0，判断检测结果为阳性，表明其含有家牛源性成分，其他样品不含上述源性成分。③比对结果：与按照或参照sn/t2980-2011、sn/t3730.7-2013、sn/t4397-2015等标准对样品进行相关源性成分检测的结果相符。
表8样品初检和复检结果：实测ct值
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110>贵州省产品质量监督检验院
<120>检测畜类源性成分的三重荧光pcr引物探针组、试剂盒及检测方法
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>1
aggccatcaccatcttcca19
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>2
cccagtgcctcctccaag18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>3
tgaccccttcattgaccttc20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>4
ttctctgccttgactgtgcc20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>5
aggcctattcctagcaatac20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>6
gtttgcgtgtatatatcgga20
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>7
atatatacatgcaaacggagc21
<210>8
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>8
ttgcgaatagaagaataactcca23
<210>9
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>9
ttcctgttccgtctctcacac21
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>10
tgttctgtctcccacacttac21
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>11
tactggaacatatagaccat20
<210>12
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>12
cagccatagtttacgtctcgg21
<210>13
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>13
cagccataatttacatctcga21
<210>14
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>14
attcatacacgtaggacgaggc22