一种重组表达载体、重组表达宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法与流程

本发明属于生物工程领域，涉及腺苷三磷酸的制备。

背景技术

腺苷三磷酸(atp)是生物体内重要的代谢物质，分子量为507，分子式为c10h16n5o13p3，作为代谢中间体、辅酶和能量供体参与生物体内多种生化反应，是生命活动及生化反应所必需的高能化合物；在体外，atp常作为酶反应的辅底物应用于工业产品如谷胱甘肽的生产。在临床上，atp也常用于进行性肌肉萎缩、心肌梗塞、心肌炎等疾病的辅助治疗。

合成atp的方法主要有化学合成法、生物酶催化法、微生物酶系发酵等。目前用于工业化生产的方法主要是以腺苷或腺苷一磷酸(amp)作为底物，利用酵母菌糖酵解途径中的酶系合成atp，但是该法存在着反应体系复杂、分离纯化困难、反应过程不易控制、产品批次间质量差异大等问题。

酶催化法相比发酵法而言，具有高效稳定、反应体系简单、反应过程容易控制等优点。如akihikomaruyama等(akihikomaruyama,tatsurofujio.atpproductionfromadeinebyaself-couplingenzymaticprocess:high-levelaccumulationunderammonium-limitedconditions,biosci,biotechnol,biochem.,65(3):644-650)报道了以腺嘌呤为底物，在产氨棒杆菌(corynebacteriumammoniagenes)催化下合成atp，反应28h后积累的atp量达到117mmol/l，底物转化率达到82％。专利申请cn106191170a公开了分别构建表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶的重组菌株，经提取或纯化后，三种酶以游离酶或固定化酶形式转化腺苷，生成atp。

然而，在atp合成领域，对于具有高底物转化率、高atp产率、高反应效率，同时反应体系组分简单、成本低的方法仍存在需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提高atp合成的底物转化率、atp产率，提高反应效率，同时简化反应体系组分，以便于操作和后续分离纯化、节约成本。为实现以上目的，本发明提供了一种包含编码腺苷激酶(ak，ec2.7.1.20)、腺苷酸激酶(adk，ec2.7.4.3)和乙酸激酶(ack，ec2.7.2.1)的多核苷酸的表达载体以及相关宿主；以及利用所述宿主细胞全细胞催化合成腺苷三磷酸的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：

第一个方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包含编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸。

其中，编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸可以以任何合适的方式存在于表达载体中，如位于不同的操纵子中，或位于同一操纵子中。在特定的实施方式中，分别编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸在同一操纵子中顺序排列。所述顺序排列表示三种酶的多核苷酸在同一操纵子中在启动子之后依次排列，三者顺序不唯一，可以按照实际要求或操作而定。

所述腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶可以是来源于任何生物、或者是经过人工改造的具有同样催化功能的酶。在特定的实施方式中，所述腺苷酸激酶和/或乙酸激酶来源于细菌，诸如来源于大肠杆菌(e.coli)，例如大肠杆菌bl21(de3)。在特定的实施方式中，所述腺苷激酶来源于酵母，例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。在更特定的实施方式中，编码所述腺苷激酶的多核苷酸的序列如seqidno:1所示，编码所述腺苷酸激酶的多核苷酸的序列如seqidno:2所示，编码所述乙酸激酶的多核苷酸的序列如seqidno:3所示。

所述表达载体可以是任何适于蛋白表达的载体。优选地，所述表达载体是为质粒；进一步地，所述表达载体为pet24a。

在另一方面，本发明提供了一种重组表达宿主，其包含:包含编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸的重组表达载体。

所述宿主可以是能够使表达载体中的蛋白稳定表达的任何宿主细胞。优选地，所述宿主是大肠杆菌，更优选地，为大肠杆菌bl21(de3)。

在另一方面，本发明提供了如上所述的重组表达载体或重组表达宿主或其表达产物或其菌悬液或其破碎物用于合成腺苷三磷酸的用途。

在另一方面，本发明提供了一种合成腺苷三磷酸的方法，包括以下步骤：

(1)构建如上所述的重组表达宿主，诱导腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的表达；

(2)向步骤(1)的反应体系中添加腺苷，同时按比例添加乙酰磷酸(acp)和/或其盐，以进行催化合成，其中所述反应体系中还包含镁离子以及起缓冲作用的阴离子和阳离子。

在特定的实施方式中，所述起缓冲作用的阳离子为钾离子、钠离子中的一种或多种；所述起缓冲作用的阴离子为磷酸根离子、四硼酸根离子中的一种或多种。

其中，表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的重组表达宿主发挥催化酶源的作用。本发明添加的底物、酶及其他组分可一次性加入所述反应体系，也可按照工艺流程分批次加入。

在特定的实施方式中，在所述构建步骤(步骤(1))之前，还可以包括：从所述腺苷激酶、所述腺苷酸激酶和所述乙酸激酶的来源生物提取基因组，并从中扩增得到编码相应酶的多核苷酸，进而构建包含编码三种酶的多核苷酸的重组表达载体。在这种情况中，所述步骤(1)进一步包括将所述重组表达载体转化到表达宿主中，使重组表达宿主细胞扩增并收集菌体。

在所述诱导表达步骤中，使用的诱导剂可以是任何合适的诱导剂。在特定的实施方式中，所述表达载体是pet24a，使用的诱导剂是乳糖。

在优选的实施方式中，所述催化合成步骤(步骤(2))的反应温度为20-50℃，更优选反应温度为30-40℃，最优选反应温度为35℃。

在优选的实施方式中，所述步骤(2)的反应ph为6.0-9.0，更优选ph为7.0-8.5，最优选ph为7.5。

优选地，在所述步骤(2)中，添加的腺苷浓度为10-30mmol/l；添加的乙酰磷酸和/或其盐的摩尔浓度为添加的腺苷的摩尔浓度的1-6倍。

优选地，在所述步骤(2)中，所述重组表达宿主的用量为1-20g/l。

优选地，在所述步骤(2)中，镁离子浓度为1-100mmol/l，更优选为5-10mmol/l；起缓冲作用的阳离子的浓度为1-100mmol/l，更优选为100mmol/l；起缓冲作用的阴离子的浓度为1-100mmol/l，更优选为50mmol/l。

优选地，在上述技术方案中，乙酰磷酸的盐可以是任何合适的乙酰磷酸盐，优选地为乙酰磷酸二锂盐、乙酰磷酸二铵盐中的一种或多种；镁离子可以是任何合适来源的镁离子，优选地来自硫酸镁、氯化镁、亚硫酸镁中的一种或多种；钾离子可以是任何合适来源的钾离子，优选地来自氯化钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种；钠离子可以是任何合适来源的钠离子，优选地来自氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、四硼酸钠中的一种或多种。

在另一方面，本发明提供了一种用于合成atp的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的重组表达宿主。优选地，所述试剂盒还包括以下中一种或更多种：用于培养所述重组表达宿主且使其表达的培养基；乙酰磷酸和/或其盐；腺苷；镁离子；钾离子、钠离子或其他合适的起缓冲作用的阳离子中的一种或更多种；磷酸根离子、四硼酸根离子或其他合适的起缓冲作用的阴离子中的一种或更多种；ph调节剂；培养装置(诸如管、瓶等)、使用说明书。其中钾离子、钠离子或其他合适的起缓冲作用的阳离子中的一种或更多种，以及磷酸根离子、四硼酸根离子或其他合适的起缓冲作用的阴离子中的一种或更多种能够使得重组表达宿主的发酵体系维持在合适的ph。

通过以上技术方案，腺苷的转化率能够高达99％以上，并且提高了atp产率。本领域技术人员能够理解到，99％以上的转化率意味着底物基本上完全转化。另外，由于本申请使用包含并同时表达三种酶的重组表达载体以及重组表达宿主全细胞进行一次性发酵，一步式生产atp，提高了反应效率。此外，本发明的方法还显著地具有以下优势：无需另外补加atp或adp或amp用于启动反应；乙酰磷酸或其盐作为底物和磷酸供体生产atp，进一步降低了反应的成本；反应后生成醋酸盐，污染小；本发明的方法用于制备的反应液中组分简单，杂质含量低，易于后续纯化工业。由此，本发明的方法能够有效降低反应的操作难度和生产成本，有利于实现工业化生产。

附图说明

图1为根据本发明的特定实施方式构建的重组质粒pet24a-ak-adk-ack图谱。

图2为根据本发明的特定实施方式所构建的重组大肠杆菌经发酵表达的腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的sds-page图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法均为常规方法，本领域技术人员根据描述可以毫无疑义地实施所述实施例并得到相应的结果。

实施例1重组大肠杆菌的构建

实验材料和试剂：

大肠杆菌bl21(de3)(e.coilbl21(de3))：购自invitrogen公司；

大肠杆菌dh5α(e.coildh5α)：购自invitrogen公司；

酿酒酵母菌株：中国典型培养物保藏中心，编号为cctccay93175；

pet24a质粒：用于表达质粒，具有t7启动子，卡那霉素抗性基因，购自novagen公司，货号69749；

腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的pcr引物：由苏州金唯智生物科技有限公司合成；

pyrobest酶及10×pyrobest缓冲液：购自takara，货号r005；

限制性内切酶ndei：购自takara，货号1161a；

限制性内切酶bamhi：购自takara，货号1010a；

限制性内切酶bglⅱ：购自takara，货号1021a；

快速连接酶solutionⅰ：购自takara，货号6022；

碱性磷酸酶(cap)：购自takara，货号2250a。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，按照《分子克隆实验指南(第三版)》(j.萨姆布鲁克、d.w.拉塞尔，黄培堂译，科学出版社，2002年8月)进行操作。

1.1重组质粒、重组表达宿主的构建和转化

分别提取大肠杆菌bl21(de3)和酿酒酵母的基因组。如下从大肠杆菌bl21(de3)基因组扩增腺苷酸激酶基因(如序列seqidno:2所示)和乙酸激酶基因(如序列seqidno:3所示)，从酿酒酵母基因组扩增腺苷激酶基因(如序列seqidno:1所示)。

需说明的是，本实施例利用限制性内切酶bamhi和bglⅱ为同尾酶的特征，在如下设计反向引物时均引入了bamhi酶切位点，而用bglⅱ酶切后的粘性末端通过与表达载体连接后再双酶切时获得，该法有助于提高操作的成功率。具体如下所述。

设计并合成腺苷激酶基因的pcr引物对：

正向引物：5’-aaaaaaaaaacatatgaccgcaccattggtag-3’(seqidno:4)；

反向引物：5’-aaaaaaaaaaggatccctatttagagtaagat-3’(seqidno:5)。

在以上所示引物中，正向引物中下划线标示的序列“catatg”为ndei酶切位点，反向引物中下划线标示的序列“ggatcc”为bamhi酶切位点。

扩增腺苷激酶基因的pcr扩增反应体系(50μl)：ddh2o37.5μl，10×pyrobest缓冲液5μl，dntp(各2.5mmol/l)4μl，正向引物(50μmol/l)(seqidno:4)1μl，反向引物(50μmol/l)(seqidno:5)1μl，模板(10ng/μl)1μl，pyrobest酶0.5μl。

扩增腺苷激酶基因的pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，16℃1min。

设计并合成腺苷酸激酶基因的pcr引物对：

正向引物：5’-aaaaaaaaaacatatgcgtatcattctgcttg-3’(seqidno:6)；

反向引物：5’-aaaaaaaaaaggatccttagccgaggattttt-3’(seqidno:7)。

在以上所示引物中，正向引物中下划线标示的序列“catatg”为ndei酶切位点，反向引物中下划线标示的序列“ggatcc”为bamhi酶切位点。

扩增腺苷酸激酶基因的pcr反应体系(50μl)：ddh2o37.5μl，10×pyrobest缓冲液5μl，dntp(各2.5mmol/l)4μl，正向引物(50μmol/l)(seqidno:6)1μl，反向引物(50μmol/l)(seqidno:7)1μl，模板(1ng/μl)1μl，pyrobest酶0.5μl。

扩增腺苷酸激酶基因的pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，16℃1min。

设计并合成乙酸激酶基因的pcr引物对：

正向引物：5’-aaaaaaaaaacatatgtcgagtaagttagtac-3’(seqidno:8)；

反向引物：5’-aaaaaaaaaaggatcctcaggcagtcaggcgg-3’(seqidno:9)。

在以上所示引物中，正向引物中下划线标示的序列“catatg”为ndei酶切位点，反向引物中下划线标示的序列“ggatcc”为bamhi酶切位点。

扩增乙酸激酶基因的pcr反应体系(50μl)：ddh2o37.5μl，10×pyrobest缓冲液5μl，dntp(各2.5mmol/l)4μl，正向引物(50μmol/l)(seqidno:8)1μl，反向引物(50μmol/l)(seqidno:9)1μl，模板(1ng/μl)1μl，pyrobest酶0.5μl。

扩增乙酸激酶基因的pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃75s，30个循环；72℃10min，16℃1min。

将通过上述方法得到的三种酶的编码序列片段进行琼脂糖凝胶电泳，并回收；将回收的三种酶基因的片段和pet24a质粒载体分别用限制性内切酶ndei于37℃处理3-4小时，再添加限制性内切酶bamhi于30℃处理3-4小时。在所述酶切过程中，载体的双酶切体系(30μl)为：10×k缓冲液3μl，限制性内切酶ndei1μl，质粒8μl，限制性内切酶bamhi1μl，ddh2o17μl；三种酶基因片段的双酶切体系分别为(30μl)：10×k缓冲液3μl，ndei1μl，基因片段10μl，bamhi1μl，ddh2o15μl。

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用axygen公司的胶回收试剂盒参考供应商提供的操作手册分别回收经酶切的三种酶的基因片段和pet24a质粒。

首先将上一步处理后的pet24a质粒分别与经酶切、回收的腺苷激酶基因片段、腺苷酸激酶基因片段和乙酸激酶基因片段，利用快速连接酶solutionⅰ连接。连接体系(12μl)分别为：基因片段5μl，载体1μl，solutionⅰ6μl。16℃保温连接3-4h后转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，分别获得重组质粒pet24a-ak(包含腺苷激酶基因的重组质粒)、pet24a-adk(包含腺苷酸激酶基因的重组质粒)和pet24a-ack(包含乙酸激酶基因的重组质粒)。将上述重组质粒pet24a-ak用限制性内切酶bamhi酶切，酶切体系(30μl)为：10×k缓冲液3μl，质粒8μl，内切酶bamhi1μl，ddh2o18μl。在30℃酶切3h后再用碱性磷酸酶(cap)处理15min，酶切体系(35μl)：10×cap缓冲液3.5μl，cap0.5μl，如上酶切的酶切体系30μl，ddh2o1μl。进行琼脂糖凝胶电泳，并回收经酶切的包含腺苷激酶基因的载体(经酶切的pet24a-ak)。用bglⅱ与bamhi双酶切处理pet24a-adk，双酶切体系(30μl)为：10×k缓冲液3μl，质粒8μl，bamhi1μl，bglⅱ1μl，ddh2o17μl。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收腺苷酸激酶基因的酶切片段。将如上得到的经酶切的pet24a-ak和腺苷酸激酶基因的酶切片段利用快速连接酶solutionⅰ连接，连接体系(12μl)为：经酶切的pet24a-ak1μl，腺苷酸激酶基因的酶切片段5μl，solutionⅰ6μl。16℃保温连接3-4h。将连接产物转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，获得重组质粒pet24a-ak-adk。将得到的重组质粒pet24a-ak-adk用bamhi酶切(bamhi的单酶切体系同上)，30℃酶切3h后用碱性磷酸酶处理15min，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收经酶切的包含ak-adk的载体(经酶切的pet24a-ak-adk)。用bglⅱ与bamhi双酶切处理pet24a-ack(bglⅱ与bamhi的双酶切体系同上)，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收乙酸激酶基因的酶切片段。将经酶切的pet24a-ak-adk和ack的酶切片段利用快速连接酶solutionⅰ连接，连接体系(12μl)为：经酶切的pet24a-ak-adk1μl，ack的酶切片段5μl，solutionⅰ6μl。16℃保温连接3-4h。将连接产物转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，获得重组质粒pet24a-ak-adk-ack。构建的重组质粒pet24a-ak-adk-ack的图谱如图1所示。

将上述得到的重组质粒pet24a-ak-adk-ack用kcm法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，筛选阳性克隆，鉴定已成功转化重组质粒，通过测序检测三种酶的表达序列全部正确。

1.2高表达菌株的筛选和扩大培养

将上述筛选的大肠杆菌bl21(de3)单克隆接入lb培养基，培养至对数期(od值为0.6-0.8)后加入乳糖至其终浓度为1％，诱导过夜(约20h)，使用离心机在8,000rpm离心10min，收集菌体。将菌体悬浮在破胞缓冲液(10mmol/ltris、10mmol/ledta、0.1mol/l氯化钠、5％甘油，ph7.0)中，使菌体浓度为50g/l。使用超声破碎仪在冰浴中破碎菌体，按照工作2s、暂停4s的程序，共超声破碎12min。分别对菌体破碎后的全组分、上清液、沉淀进行sds-page电泳以检测蛋白表达。图2为表明三种酶蛋白表达情况(蛋白表达总量、是否可溶性表达)的图，示出了如上构建的重组大肠杆菌的示例性sds-page图，泳道1为蛋白标志物14.4-116kda(购自thermo公司)；泳道2为菌体破碎后的全组分；泳道3为菌体破碎后的上清液；泳道4为菌体破碎后的沉淀。

将不同单克隆分别发酵培养，按如上所述的方法破碎后，进行sds-page电泳检测，根据电泳检测结果筛选高表达菌株。将高表达菌株如下进行5l发酵培养。在含50μg/ml卡那霉素的100ml种子培养基中加入1‰重组大肠杆菌甘油冻存管菌液，在震荡恒温培养箱中37℃、220r/min培养过夜。将如上得到的含有重组大肠杆菌的种子培养液按2％移种量接种至5l发酵培养基中，在8l规格的发酵罐中发酵培养约3h，待培养基降温至25℃后加入预先配置并灭菌的30％乳糖至终浓度为1％作为诱导剂，在25℃继续发酵过夜。使用离心机在8,000rpm/min离心10min，收集菌体后保存于-20℃用于后续反应。

其中种子培养基成分为：酵母抽提物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，ph7.0。发酵培养基成分为：蛋白胨15g/l，酵母抽提物25g/l，磷酸氢二钾10g/l，甘油15g/l，6mol/l氢氧化钠调ph至7.5。

实施例2重组大肠杆菌全细胞催化合成atp

在反应体系(1l)中加入10mmol/l腺苷、50mmol/l硼砂、50mmol/lacp和5mmol/l硫酸镁，加入10g/l如上在实施例1中收集的菌体作为酶源，调节反应液ph至7.5，反应过程中控制温度35℃，在机械搅拌下以150r/min的搅拌速度反应3小时。

收集反应液的上清液，过滤除菌后使用高效液相色谱仪(agilent1260)通过高效液相色谱法(hplc)分析剩余腺苷的浓度；对于生成的atp的浓度检测，将上清液稀释10倍，过滤除菌后通过hplc分析。

hplc条件：welchultimatexb-c18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm粒径，购自月旭科技(上海)股份有限公司，货号为00201-31043)；进样量：10μl；检测波长：260nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：0.2mol/l甲酸铵+0.1％辛烷磺酸钠(甲酸调节ph至2.8)：甲醇＝95:5；等度洗脱。

分别使用atp标准品(购自中国食品药品检定研究院，货号为140674)、腺苷标准品(购自中国食品药品检定研究院，货号110879)制作标准曲线，并计算atp和腺苷浓度。在本实施例中，经计算，生成的atp的浓度为5g/l。

根据如上计算得到的腺苷浓度，利用如下公式计算腺苷转化率：腺苷转化率＝(1-反应结束后腺苷峰面积按标准曲线换算后的质量浓度/初始投入的腺苷浓度)*100％。经计算，在本实施例中腺苷转化率为99％。

实施例3重组大肠杆菌全细胞催化合成atp

在反应体系(1l)中加入30mmol/l腺苷、50mmol/l硼砂、180mmol/lacp和10mmol/l硫酸镁，加入5g/l菌体作为酶源，调节反应液ph至7.5，反应过程中控制温度30℃，在机械搅拌下以150r/min的搅拌速度反应5小时。按照实施例2中所描述的方法测量atp和腺苷浓度。生成atp浓度为15.1g/l，按如实施例2中所描述的方法计算，腺苷转化率为99％以上。

实施例4重组大肠杆菌全细胞催化合成atp

在反应体系(1l)中加入30mmol/l腺苷、50mmol/l硼砂、135mmol/lacp和5mmol/l硫酸镁，加入2g/l菌体作为酶源，调节反应液ph至7.5，反应过程中控制温度35℃，在机械搅拌下以150r/min的搅拌速度反应3小时。按照实施例2中描述的方法测量atp和腺苷浓度。生成atp浓度为15.1g/l，按如实施例2中所描述的方法计算，腺苷转化率为99％以上。

序列表

<110>浙江海正药业股份有限公司

<120>一种重组大肠杆菌表达载体、重组表达宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法

<130>dp1f180431zx

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<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

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<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>