一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增引物及其应用的制作方法

文档序号:15457590发布日期:2018-09-15 01:34

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域,具体说是涉及一种快速、简便、低成本检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增引物及其应用。



背景技术:

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia, Kpn)为肠杆菌科克雷伯氏菌属的革兰氏阴性菌。可侵害人和动物的肠道、呼吸道等器官,从而可引起肺炎、肝脓肿、伤口感染和败血症等症状,是一种人兽共患病的病原。同时,牛感染肺炎克雷伯氏菌后,对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌以及牛支原体等病原的易感性增加。目前,该病原体在全球范围内均有分布,在中国的分布流行同样十分广泛,造成巨大的经济损失,成为威胁牛养殖业的重要病原之一。

迄今为止,国内外检测的肺炎克雷伯氏菌的手段报道较少。主要有ELISA方法、细菌培养分离革兰氏染色鉴定、生化试验等。这些技术不仅耗时长,且检测不灵敏,而PCR方法不仅可以快速灵敏诊断出病原,而且对于潜伏期的病原感染,其特异性更强。



技术实现要素:

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题,提供一种低成本、快速、准确地检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为:包括样品采集,病原基因组DNA的提取,特异性引物的设计和优化,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物和结果判定。

一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增引物,所述的PCR扩增引物是依据肺炎克雷伯氏菌的phoE基因进行设计,扩增的目的片段大小为571bp,引物的序列分别为:

Forward primer:5’- CCATGCACTACTTCAGCGAT -3’ SEQ ID NO:1

Reverse primer:5’- CAGGCTTCCGCTTTCGAAC -3’ SEQ ID NO:2

使用前将引物浓度稀释至25 pmol/μL。

优选的,将所述的PCR 扩增引物在制备检测肺炎克雷伯氏菌试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增试剂盒,包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

优选的,还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶和RNase-Free water,利用快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增试剂盒建立PCR扩增方法,其反应体系建立以25 μL计,

10×PCR Buffer 5 μL

dNTPs(10mM each ) 2 μL

ES-Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1 μL

Forward primer(25 pmol/μL) 1 μL

Reverse primer(25 pmol/μL) 1 μL

DNA模板 3 μL

RNase-Free water 补足25 μL。

优选的,所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mM Tris-HCL。

优选的所述的PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95 ℃ 5 min;随后进行35个95 ℃ 35 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72 ℃延伸10 min。

以上所述的一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增试剂盒,所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法:将PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立,如果从样品中扩增出了571 bp的特异性条带,则说明该样品存在肺炎克雷伯氏菌;如果样品没有扩增出571 bp的特异性条带,则说明该样品不含有肺炎克雷伯氏菌。

本发明的实质性特点和显著的进步是:

1)特异性强

本发明的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法特异性检测出肺炎克雷伯氏菌,所检测的阴性对照病原如隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、大肠杆菌和水对照均无阳性结果。

2)灵敏度高

本发明的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法灵敏度高,最小检测限为3.88×10-4 ng/μL。

3)耗时少、成本低廉

与通过病原分离鉴定来检测相比,本发明的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法,在时间成本、工作量等方面具有明显的优势,从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定,可在5小时内完成。

4)准确性高、稳定性好

用3.88×101 ng/μL、3.88×100 ng/μL、3.88×10-1 ng/μL、3.88×10-2 ng/μL、3.88×10-3、3.88×10-4 ng/μL和3.88×10-5 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR,分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致,表明建立的PCR检测方法的反应体系重复性好。

附图说明

图1是退火温度筛选试验结果:其中M:DNA marker 100 bp ladder 、1:50℃、2:52℃、

3:54℃、4:56℃、5:58℃、6:60℃、7:62℃、8:水对照。

图2特异性检测结果:其中M:DNA marker 100bp ladder、1:肺炎克雷伯氏菌、2:隐秘杆菌、3:溶血性曼氏杆菌、4:巴氏杆菌、5:牛支原体、6:牛副流感病毒3型、7:牛传染性鼻气管炎病毒、8:大肠杆菌、9:水对照

图3是敏感性检测结果:其中M:DNA marker 100bp ladder、1:3.88×101 ng/μL、2:3.88×100 ng/μL、3:3.88×10-1 ng/μL、4:3.88×10-2 ng/μL、5:3.88×10-3 ng/μL、6 3.88×10-4 ng/μL、7:3.88×10-5 ng/μL;8:水对照。

图4是临床样品检测电泳图:其中M:DNA marker 100bp ladder、其中,泳道1:阳性对照;2:阴性对照;泳道4、5、7、9、12、14、15、18为阳性结果;泳道3、6、8、10、11、13、16、17、19、20为阴性结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1 建立快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR方法

1、材料的准备

肺炎克雷伯氏菌、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒和大肠杆菌为广西兽医研究所分离鉴定保存,组织样品来自兽医临床。10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、DNA/RNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

2 、PCR引物的设计与合成

根据GenBank 中的肺炎克雷伯氏菌phoE基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,利用Oligo 7.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物,其中引物的序列分别为:

Forward primer:5’- CCATGCACTACTTCAGCGAT -3’ SEQ ID NO:1

Reverse primer:5’- CAGGCTTCCGCTTTCGAAC -3’ SEQ ID NO:2

扩增的目的基因片段大小为571 bp,

上、下游引物使用前稀释到25 pmol/μL。

3、模板DNA的提取

样品处理:

(1)纯细菌培养物:取适量至于灭菌离心管中,则离心后弃上清,取沉淀;

(2)组织样品:首先进行研磨,反复冻融,离心后取上清。

再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

4、PCR反应体系建立

所述的快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR方法,其反应体系建立以25 μL计

10×PCR Buffer 5 μL

dNTPs(10mM each ) 2 μL

ES-Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1 μL

Forward primer(25 pmol/μL) 1 μL

Reverse primer(25 pmol/μL) 1 μL

DNA模板 3 μL

RNase-Free water 补足25 μL。

5、PCR反应程序

所述的快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR方法的反应程序,首选进行最佳退火温度确定试验,确定退火温度后,使用的PCR反应程序为95 ℃ 5 min;随后进行35个95 ℃ 35 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72 ℃延伸10 min。

6、结果判定

所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法: 将PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立,如果从样品中扩增出了571 bp的特异性条带,则说明该样品存在肺炎克雷伯氏菌;如果样品没有扩增出571 bp的特异性条带,则说明该样品不含有肺炎克雷伯氏菌。

7、特异性检测

以提取的试验株和对照株的基因组DNA/RNA(RNA病毒先进行反转录为cDNA)进行PCR扩增,检验PCR方法的特异性。

8、敏感性检测

将肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,经PCR鉴定,重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒,测定起始浓度后,用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释,采用优化的反应条件进行PCR扩增,进行敏感性检测。

9、重复性检测

用3.88×101 ng/μL、3.88×100 ng/μL、3.88×10-1 ng/μL、3.88×10-2 ng/μL、3.88×10-3、3.88×10-4 ng/μL和3.88×10-5 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR,分别重复3次检测,检验本发明检测方法的准确性和稳定性。

10、临床样品检测

将临床采集的50份组织样品分别研磨,反复冻融,使用试剂盒提取基因组DNA,使用建立的PCR方法进行扩增。

实施例2快速检测肺炎克雷伯氏菌PCR方法的退火温度试验

分别对退火温度50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃进行PCR扩增,确定最佳的退火温度。结果显示,所设计的引物对退火温度的包容性大,在退火温度为50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃的反应程序下,均能很好的扩增出单一的目的条带(图1)。为此,本PCR方法使用的反应程序为:95 ℃ 5 min;随后进行35个95 ℃ 35 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72℃ 10 min延伸。

实施例3 检测肺炎克雷伯氏菌PCR方法的特异性检测结果

提取肺炎克雷伯氏菌、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒和大肠杆菌的基因组DNA/RNA(RNA进行反转录为cDNA),使用优化好的反应体系和反应程序进行PCR扩增,检测本发明检测方法的特异性,结果显示,只有肺炎克雷伯氏菌样品扩增出了目的片段条带,为阳性结果,7株对照株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带,为阴性结果(图2),表明本方法具有很好的特异性。

实施例4检测肺炎克雷伯氏菌PCR方法的的敏感性检测结果

将肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,经PCR鉴定,重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒,测定起始浓度为3.88×101 ng/μL后,用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释,采用优化的反应条件进行PCR扩增,进行敏感性检测,结果显示,建立的PCR检测方法最低检测限为3.88×10-4 ng/μL(图3)。

实施例5 肺炎克雷伯氏菌PCR方法的准确性和稳定性检测结果

用3.88×101 ng/μL、3.88×100 ng/μL、3.88×10-1 ng/μL、3.88×10-2 ng/μL、3.88×10-3、3.88×10-4 ng/μL和3.88×10-5 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增,分别重复3次检测。结果显示,重复结果良好,表明建立的PCR检测方法重复性好、稳定性高。

实施例6 肺炎克雷伯氏菌PCR方法的初步应用

将临床采集的50份组织样品分别研磨,反复冻融,使用试剂盒提取基因组DNA,分别PCR扩增。图4展示其中18份样品的检测结果,结果表明,有8份样品检测出肺炎克雷伯氏菌的特异性条带,为阳性结果。

以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增引物及其应用

<141> 2018-05-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

ccatgcacta cttcagcgat 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

caggcttccg ctttcgaac 19

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1