本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体说是涉及一种快速、简便、低成本检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增引物及其应用。
背景技术：
肺炎克雷伯氏菌（klebsiellapneumonia,kpn）为肠杆菌科克雷伯氏菌属的革兰氏阴性菌。可侵害人和动物的肠道、呼吸道等器官，从而可引起肺炎、肝脓肿、伤口感染和败血症等症状，是一种人兽共患病的病原。同时，牛感染肺炎克雷伯氏菌后，对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌以及牛支原体等病原的易感性增加。目前，该病原体在全球范围内均有分布，在中国的分布流行同样十分广泛，造成巨大的经济损失，成为威胁牛养殖业的重要病原之一。
迄今为止，国内外检测的肺炎克雷伯氏菌的手段报道较少。主要有elisa方法、细菌培养分离革兰氏染色鉴定、生化试验等。这些技术不仅耗时长，且检测不灵敏，而pcr方法不仅可以快速灵敏诊断出病原，而且对于潜伏期的病原感染，其特异性更强。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种低成本、快速、准确地检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：包括样品采集，病原基因组dna的提取，特异性引物的设计和优化，pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物和结果判定。
一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增引物，所述的pcr扩增引物是依据肺炎克雷伯氏菌的phoe基因进行设计，扩增的目的片段大小为571bp，引物的序列分别为：
forwardprimer：5’-ccatgcactacttcagcgat-3’seqidno:1
reverseprimer：5’-caggcttccgctttcgaac-3’seqidno:2
使用前将引物浓度稀释至25pmol/μl。
优选的，将所述的pcr扩增引物在制备检测肺炎克雷伯氏菌试剂盒的应用。
本发明还提供一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增试剂盒，包括具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，还包括10×pcrbuffer、dntps、es-taqdna聚合酶和rnase-freewater，利用快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增试剂盒建立pcr扩增方法，其反应体系建立以25μl计，
10×pcrbuffer5μl
dntps（10mmeach）2μl
es-taqdna聚合酶（5u/μl）1μl
forwardprimer（25pmol/μl）1μl
reverseprimer（25pmol/μl）1μl
dna模板3μl
rnase-freewater补足25μl。
优选的，所述的10×pcrbuffer包含kcl20-30mm、mgso43-10mm、10-20mmtris-hcl。
优选的所述的pcr扩增试剂盒中pcr反应程序为95℃5min；随后进行35个95℃35s，58℃40s，72℃45s的循环；最后72℃延伸10min。
以上所述的一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增试剂盒，所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了571bp的特异性条带，则说明该样品存在肺炎克雷伯氏菌；如果样品没有扩增出571bp的特异性条带，则说明该样品不含有肺炎克雷伯氏菌。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的肺炎克雷伯氏菌的pcr检测方法特异性检测出肺炎克雷伯氏菌，所检测的阴性对照病原如隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、大肠杆菌和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高
本发明的肺炎克雷伯氏菌的pcr检测方法灵敏度高，最小检测限为3.88×10-4ng/μl。
3）耗时少、成本低廉
与通过病原分离鉴定来检测相比，本发明的肺炎克雷伯氏菌的pcr检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用3.88×101ng/μl、3.88×100ng/μl、3.88×10-1ng/μl、3.88×10-2ng/μl、3.88×10-3、3.88×10-4ng/μl和3.88×10-5ng/μl的重组质粒标准样品同时进行pcr，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的pcr检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是退火温度筛选试验结果：其中m：dnamarker100bpladder、1：50℃、2：52℃、
3：54℃、4：56℃、5：58℃、6：60℃、7：62℃、8：水对照。
图2特异性检测结果：其中m：dnamarker100bpladder、1：肺炎克雷伯氏菌、2：隐秘杆菌、3：溶血性曼氏杆菌、4：巴氏杆菌、5：牛支原体、6：牛副流感病毒3型、7：牛传染性鼻气管炎病毒、8：大肠杆菌、9：水对照
图3是敏感性检测结果：其中m：dnamarker100bpladder、1：3.88×101ng/μl、2：3.88×100ng/μl、3：3.88×10-1ng/μl、4：3.88×10-2ng/μl、5：3.88×10-3ng/μl、63.88×10-4ng/μl、7：3.88×10-5ng/μl；8：水对照。
图4是临床样品检测电泳图：其中m：dnamarker100bpladder、其中，泳道1：阳性对照；2：阴性对照；泳道4、5、7、9、12、14、15、18为阳性结果；泳道3、6、8、10、11、13、16、17、19、20为阴性结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1建立快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr方法
1、材料的准备
肺炎克雷伯氏菌、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒和大肠杆菌为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。10×pcrbuffer、dntps、es-taqdna聚合酶、dna/rna提取试剂盒、细菌基因组dna提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
2、pcr引物的设计与合成
根据genbank中的肺炎克雷伯氏菌phoe基因序列进行同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，利用oligo7.0引物设计软件和blast软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
forwardprimer：5’-ccatgcactacttcagcgat-3’seqidno:1
reverseprimer：5’-caggcttccgctttcgaac-3’seqidno:2
扩增的目的基因片段大小为571bp，
上、下游引物使用前稀释到25pmol/μl。
3、模板dna的提取
样品处理：
（1）纯细菌培养物：取适量至于灭菌离心管中，则离心后弃上清，取沉淀；
（2）组织样品：首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。
再使用细菌基因组dna提取试剂盒提取。
4、pcr反应体系建立
所述的快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr方法，其反应体系建立以25μl计
10×pcrbuffer5μl
dntps（10mmeach）2μl
es-taqdna聚合酶（5u/μl）1μl
forwardprimer（25pmol/μl）1μl
reverseprimer（25pmol/μl）1μl
dna模板3μl
rnase-freewater补足25μl。
5、pcr反应程序
所述的快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的pcr反应程序为95℃5min；随后进行35个95℃35s，58℃40s，72℃45s的循环；最后72℃延伸10min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了571bp的特异性条带，则说明该样品存在肺炎克雷伯氏菌；如果样品没有扩增出571bp的特异性条带，则说明该样品不含有肺炎克雷伯氏菌。
7、特异性检测
以提取的试验株和对照株的基因组dna/rna（rna病毒先进行反转录为cdna）进行pcr扩增，检验pcr方法的特异性。
8、敏感性检测
将肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增的目的片段与pmd-18t载体连接，转化大肠杆菌dh5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经pcr鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度后，用rna-freewater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行pcr扩增，进行敏感性检测。
9、重复性检测
用3.88×101ng/μl、3.88×100ng/μl、3.88×10-1ng/μl、3.88×10-2ng/μl、3.88×10-3、3.88×10-4ng/μl和3.88×10-5ng/μl的重组质粒标准样品同时进行pcr，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
10、临床样品检测
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组dna，使用建立的pcr方法进行扩增。
实施例2快速检测肺炎克雷伯氏菌pcr方法的退火温度试验
分别对退火温度50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃进行pcr扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性大，在退火温度为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。为此，本pcr方法使用的反应程序为：95℃5min；随后进行35个95℃35s，58℃40s，72℃45s的循环；最后72℃10min延伸。
实施例3检测肺炎克雷伯氏菌pcr方法的特异性检测结果
提取肺炎克雷伯氏菌、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒和大肠杆菌的基因组dna/rna（rna进行反转录为cdna），使用优化好的反应体系和反应程序进行pcr扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有肺炎克雷伯氏菌样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，7株对照株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带，为阴性结果（图2），表明本方法具有很好的特异性。
实施例4检测肺炎克雷伯氏菌pcr方法的的敏感性检测结果
将肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增的目的片段与pmd-18t载体连接，转化大肠杆菌dh5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经pcr鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度为3.88×101ng/μl后，用rna-freewater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行pcr扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的pcr检测方法最低检测限为3.88×10-4ng/μl（图3）。
实施例5肺炎克雷伯氏菌pcr方法的准确性和稳定性检测结果
用3.88×101ng/μl、3.88×100ng/μl、3.88×10-1ng/μl、3.88×10-2ng/μl、3.88×10-3、3.88×10-4ng/μl和3.88×10-5ng/μl的标准样品同时进行pcr扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的pcr检测方法重复性好、稳定性高。
实施例6肺炎克雷伯氏菌pcr方法的初步应用
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组dna，分别pcr扩增。图4展示其中18份样品的检测结果，结果表明，有8份样品检测出肺炎克雷伯氏菌的特异性条带，为阳性结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的pcr扩增引物及其应用
<141>2018-05-30
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>1
ccatgcactacttcagcgat20
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>2
caggcttccgctttcgaac19