一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒的制作方法

文档序号:15457620发布日期:2018-09-15 01:34

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域,具体涉及一种快速、简便、低成本检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒。



背景技术:

牛流行热是由牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus, BEFV)引起牛的急性、热性的传染疾病。患病动物临床上表现为突然发热、精神沉郁、僵硬、流泪、跛行等。本病有明显的季节性,多发生于雨量多和气候炎热的6月~9月。该病的发病率高达80%,而在无并发症的情况下病死率较低,很少超过2%~3%,但是过度肥胖的牛病死率可高达30%。一般认为本病可经过呼吸道感染以及吸血昆虫的叮咬等进行传播。

Schwinfuth于1867首次在东非报道牛流行热,随后津巴布韦、印度尼西亚、日本等国都有报道。我国是1976年首次分离到BEFV。该病毒为单股负链RNA病毒,属于弹状病毒科,暂时热病毒属。现诊断牛流行热的方法很多,可根据临床症状以及病理变化做出初步诊断,还可以通过ELISA、补体结合试验、中和试验等技术进行诊断,但是这些试验都存在缺点,即反应时间长、材料多、检测时间具有明显的滞后性。而且,血清学诊断方法存在着种间的交叉反应、非特异性反应,极大阻碍了血清学方法的应用,影响检测效果。

然而,RT-PCR这种先进的分子生物学检测手段,不仅可以快速准确的检测病原,而且其检测方法特异性强、敏感性高。由于G蛋白是BEFV主要的免疫原性蛋白,因此,本发明以G基因为靶基因设计特异性引物,建立一种RT-PCR快速检测方法,为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。



技术实现要素:

针对养牛业健康发展的实际需要,本发明的目的是建立一种低成本、快速、准确地检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为:

本发明提供一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物,所述RT-PCR引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。

优选的,所述RT-PCR引物是依据牛流行热病毒的G基因进行设计,扩增的目的片段大小为235 bp。

优选的,所述的RT-PCR引物在制备检测牛流行热病毒试剂盒的应用。

本发明还提供一种如以上所述快速检测牛流行热病毒的RT-PCR试剂盒,所述RT-PCR试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

优选的,所述RT-PCR试剂盒还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、cDNA模板和超纯水。

优选的,所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol/μL。

优选的,所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mM Tris-HCL。

优选的,所述RT-PCR试剂盒中RT-PCR反应程序为95 ℃ 5 min;随后进行30个95 ℃ 30 s,50 ℃ 35 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72 ℃延伸10 min。

优选的,所述RT-PCR试剂盒的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法:将RT-PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,观察是否有目的条带;首先阳性对照和阴性对照成立,如果从样品中扩增出了235 bp的特异性条带,则说明该样品存在牛流行热病毒;如果样品没有扩增出235 bp的特异性条带,则说明该样品不含有牛流行热病毒。

由于G蛋白是BEFV主要的免疫原性蛋白,因此,本发明以G基因为靶基因设计特异性引物,建立一种RT-PCR快速检测方法,为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。

本发明的实质性特点和显著的进步是:

1)特异性强

本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法特异性检测出牛流行热病毒,所检测的阴性对照病原(溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型)和水对照均无阳性结果。

2)灵敏度高

本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法灵敏度高,最小检测限为8.01×10-4 ng/μL。

3)耗时少、成本低廉

与通过病原分离鉴定来检测相比,本发明的牛流行热病毒的RT-PCR检测方法,在时间成本、工作量等方面具有明显的优势,从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定,可在5小时内完成。

4)准确性高、稳定性好

用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行RT-PCR,分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致,表明建立的RT-PCR检测方法的反应体系重复性好。

附图说明

图1是最佳退火温度筛选试验结果,其中M:DNA marker DM2000、1:47 ℃、2:48 ℃、 3:49 ℃、4:50 ℃、 5:51 ℃、6:52 ℃、N:水对照;结果显示,所设计的引物对退火温度包容性强,在退火温度为47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃的反应程序下,均能很好的扩增出单一的目的条带。

图2特异性检测结果,其中M:DNA marker DM2000、1:牛流行热病毒、2:溶血性曼氏杆菌、3:化脓性隐秘杆菌、4:多杀巴氏杆菌、5:大肠杆菌、6:肺炎克雷伯氏杆菌、7:牛传染性鼻气管炎病、8:牛副流感病毒3型、9:水对照。

图3是本发明敏感性检测结果:其中M:DNA marker DM2000、1:8.01×101 ng/μL、2: 8.01×100 ng/μL、3:8.01×10-1 ng/μL、4:8.01×10-2 ng/μL、5:8.01×10-3 ng/μL、 6:8.01×10-4 ng/μL 、7:8.01×10-5 ng/μL、8:8.01×10-6 ng/μL、 9:水对照。

图4是临床样品的RT-PCR检测结果,其中M:DNA marker DM2000、其中,泳道P:阳性对照;N:阴性对照;泳道3、4、7、8、9、13、15为阳性结果;泳道1、2、5、6、10、11、12、14、16、17、18、19为阴性结果。

具体实施方式

实施例1 建立快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法

1、材料的准备

牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型为广西兽医研究所分离鉴定保存,组织样品来自兽医临床。10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、DNA/RNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit购自康为世纪生物科技有限公司。

2 、RT-PCR引物的设计与合成

根据GenBank 中的牛流行热病毒G基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,利用Oligo 7.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物,其中引物的序列分别为:

Forward primer:5’- CTGTAGGTGCAATAGTCACAA-3’

Reverse primer:5’- AAGAACCTATCATCACCGATT-3’

扩增的目的基因片段大小为235 bp,

上、下游引物使用前稀释到25 pmol/μL 。

3、模板RNA的提取

使用DNA/RNA提取试剂盒提取试验毒株的RNA,以及疑似牛流行热病毒感染引起病变组织的RNA,再使用反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA。

4、PCR反应体系建立

所述的快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法,其反应体系建立以25 μL计

10×PCR Buffer 5 μL

dNTPs(10mM each ) 2 μL

ES-Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1 μL

Forward primer(25 pmol/μL) 1 μL

Reverse primer(25 pmol/μL) 1 μL

cDNA模板 2 μL

超纯水 补足25 μL。

5、RT-PCR反应程序

所述的快速检测牛流行热病毒的RT-PCR方法的反应程序,首选进行最佳退火温度确定试验,确定退火温度后,使用的所述的PCR反应程序为95 ℃ 5 min;随后进行30个95 ℃ 30 s,50 ℃ 35 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72 ℃延伸10 min。

6、结果判定

所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法:将PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立,如果从样品中扩增出了235 bp的特异性条带,则说明该样品存在牛流行热病毒;如果样品没有扩增出235 bp的特异性条带,则说明该样品不含有牛流行热病毒。

7、特异性检测

以提取的试验株和对照株的基因组RNA/DNA(RNA先进行反转录为cDNA)进行PCR扩增,检验PCR方法的特异性。

8、敏感性检测

将牛流行热病毒的RT-PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,经PCR鉴定,重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒,测定起始浓度后,用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释,采用优化的反应条件进行PCR扩增,进行敏感性检测。

9、重复性检测

用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR,分别重复3次检测,检验本发明检测方法的准确性和稳定性。

10、临床样品检测

将临床采集的50份组织样品分别研磨,反复冻融,使用试剂盒提取基因组RNA,使用建立的RT-PCR方法进行扩增。

实施例2快速检测牛流行热病毒RT-PCR方法的退火温度试验

分别对退火温度47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃进行RT-PCR扩增,确定最佳的退火温度。结果显示,所设计的引物对退火温度的包容性大,在退火温度为47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃的反应程序下,均能很好的扩增出单一的目的条带(图1)。为此,本PCR方法使用的反应程序为: 95 ℃ 5 min;随后进行30个95 ℃ 30 s,50 ℃ 35 s,72 ℃ 45 s的循环;最后72 ℃延伸10 min。

实施例3 检测牛流行热病毒RT-PCR方法的特异性检测结果

提取牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型,使用优化好的反应体系和反应程序进行RT-PCR/PCR扩增,检测本发明检测方法的特异性,结果显示,只有牛流行热病毒样品扩增出了目的片段条带,为阳性结果,7株对照株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带,为阴性结果(图2),表明本方法具有很好的特异性。

实施例4检测牛流行热病毒RT-PCR方法的的敏感性检测结果

牛流行热病毒RT-PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,经PCR鉴定,重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒,测定起起始浓度后,用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释,采用优化的反应条件进行PCR扩增,进行敏感性检测,结果显示,建立的PCR检测方法最低检测限为8.01 ×10-4 ng/μL(图3)。

实施例5牛流行热病毒RT-PCR方法的准确性和稳定性检测结果

用8.01×101 ng/μL、8.01×100 ng/μL、8.01×10-1 ng/μL、8.01×10-2 ng/μL、8.01×10-3 ng/μL、8.01×10-4 ng/μL、8.01×10-5 ng/μL和8.01×10-6 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增,分别重复3次检测。结果显示,重复结果良好,表明建立的RT-PCR检测方法重复性好、稳定性高。

实施例6 牛流行热病毒RT-PCR方法的初步应用

将临床采集的50份组织样品分别研磨,反复冻融,使用DNA/RNA提取试剂盒(CW0548S,北京康为世纪生物科技有限公司)提取组织样品的病原基因组RNA,再使用反转录试剂盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit(CW2569M,北京康为世纪生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA,按试剂盒说明书进行,以此为模板,使用建立的PCR方法进行扩增。结果显示,有7份样品检测出牛流行热病毒的特异性条带,为阳性结果(图4展示了19份样品的检测结果)。

以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种快速检测牛流行热病毒的RT-PCR引物及试剂盒

<141> 2018-05-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

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<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

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