本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒。
背景技术：
牛流行热是由牛流行热病毒（bovineephemeralfevervirus,befv）引起牛的急性、热性的传染疾病。患病动物临床上表现为突然发热、精神沉郁、僵硬、流泪、跛行等。本病有明显的季节性，多发生于雨量多和气候炎热的6月~9月。该病的发病率高达80%，而在无并发症的情况下病死率较低，很少超过2%~3%，但是过度肥胖的牛病死率可高达30%。一般认为本病可经过呼吸道感染以及吸血昆虫的叮咬等进行传播。
schwinfuth于1867首次在东非报道牛流行热，随后津巴布韦、印度尼西亚、日本等国都有报道。我国是1976年首次分离到befv。该病毒为单股负链rna病毒，属于弹状病毒科，暂时热病毒属。现诊断牛流行热的方法很多，可根据临床症状以及病理变化做出初步诊断，还可以通过elisa、补体结合试验、中和试验等技术进行诊断，但是这些试验都存在缺点，即反应时间长、材料多、检测时间具有明显的滞后性。而且，血清学诊断方法存在着种间的交叉反应、非特异性反应，极大阻碍了血清学方法的应用，影响检测效果。
然而，rt-pcr这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。由于g蛋白是befv主要的免疫原性蛋白，因此，本发明以g基因为靶基因设计特异性引物，建立一种rt-pcr快速检测方法，为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。
技术实现要素：
针对养牛业健康发展的实际需要，本发明的目的是建立一种低成本、快速、准确地检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
本发明提供一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物，所述rt-pcr引物由具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物组成。
优选的，所述rt-pcr引物是依据牛流行热病毒的g基因进行设计，扩增的目的片段大小为235bp。
优选的，所述的rt-pcr引物在制备检测牛流行热病毒试剂盒的应用。
本发明还提供一种如以上所述快速检测牛流行热病毒的rt-pcr试剂盒，所述rt-pcr试剂盒包括具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，所述rt-pcr试剂盒还包括10×pcrbuffer、dntps、es-taqdna聚合酶、cdna模板和超纯水。
优选的，所述rt-pcr试剂盒的seqidno:1引物和seqidno:2引物使用浓度为25pmol/μl。
优选的，所述的10×pcrbuffer包含kcl20-30mm、mgso43-10mm、10-20mmtris-hcl。
优选的，所述rt-pcr试剂盒中rt-pcr反应程序为95℃5min；随后进行30个95℃30s，50℃35s，72℃45s的循环；最后72℃延伸10min。
优选的，所述rt-pcr试剂盒的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将rt-pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带；首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了235bp的特异性条带，则说明该样品存在牛流行热病毒；如果样品没有扩增出235bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛流行热病毒。
由于g蛋白是befv主要的免疫原性蛋白，因此，本发明以g基因为靶基因设计特异性引物，建立一种rt-pcr快速检测方法，为早期牛流行热病毒诊断提供一种有效、可行性的诊断方法。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的牛流行热病毒的rt-pcr检测方法特异性检测出牛流行热病毒，所检测的阴性对照病原（溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型）和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高
本发明的牛流行热病毒的rt-pcr检测方法灵敏度高，最小检测限为8.01×10-4ng/μl。
3）耗时少、成本低廉
与通过病原分离鉴定来检测相比，本发明的牛流行热病毒的rt-pcr检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用8.01×101ng/μl、8.01×100ng/μl、8.01×10-1ng/μl、8.01×10-2ng/μl、8.01×10-3ng/μl、8.01×10-4ng/μl、8.01×10-5ng/μl和8.01×10-6ng/μl的重组质粒标准样品同时进行rt-pcr，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的rt-pcr检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是最佳退火温度筛选试验结果，其中m：dnamarkerdm2000、1：47℃、2：48℃、3：49℃、4：50℃、5：51℃、6：52℃、n：水对照；结果显示，所设计的引物对退火温度包容性强，在退火温度为47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带。
图2特异性检测结果，其中m：dnamarkerdm2000、1：牛流行热病毒、2：溶血性曼氏杆菌、3：化脓性隐秘杆菌、4：多杀巴氏杆菌、5：大肠杆菌、6：肺炎克雷伯氏杆菌、7：牛传染性鼻气管炎病、8：牛副流感病毒3型、9：水对照。
图3是本发明敏感性检测结果：其中m：dnamarkerdm2000、1：8.01×101ng/μl、2：8.01×100ng/μl、3：8.01×10-1ng/μl、4：8.01×10-2ng/μl、5：8.01×10-3ng/μl、6：8.01×10-4ng/μl、7：8.01×10-5ng/μl、8：8.01×10-6ng/μl、9：水对照。
图4是临床样品的rt-pcr检测结果，其中m：dnamarkerdm2000、其中，泳道p：阳性对照；n：阴性对照；泳道3、4、7、8、9、13、15为阳性结果；泳道1、2、5、6、10、11、12、14、16、17、18、19为阴性结果。
具体实施方式
实施例1建立快速检测牛流行热病毒的rt-pcr方法
1、材料的准备
牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。10×pcrbuffer、dntps、es-taqdna聚合酶、dna/rna提取试剂盒、细菌基因组dna提取试剂盒、反转录试剂盒hifiscriptcdnasynthesiskit购自康为世纪生物科技有限公司。
2、rt-pcr引物的设计与合成
根据genbank中的牛流行热病毒g基因序列进行同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，利用oligo7.0引物设计软件和blast软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
forwardprimer：5’-ctgtaggtgcaatagtcacaa-3’
reverseprimer：5’-aagaacctatcatcaccgatt-3’
扩增的目的基因片段大小为235bp，
上、下游引物使用前稀释到25pmol/μl。
3、模板rna的提取
使用dna/rna提取试剂盒提取试验毒株的rna，以及疑似牛流行热病毒感染引起病变组织的rna，再使用反转录试剂盒hifiscriptcdnasynthesiskit将rna反转录为cdna。
4、pcr反应体系建立
所述的快速检测牛流行热病毒的rt-pcr方法，其反应体系建立以25μl计
10×pcrbuffer5μl
dntps（10mmeach）2μl
es-taqdna聚合酶（5u/μl）1μl
forwardprimer（25pmol/μl）1μl
reverseprimer（25pmol/μl）1μl
cdna模板2μl
超纯水补足25μl。
5、rt-pcr反应程序
所述的快速检测牛流行热病毒的rt-pcr方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的所述的pcr反应程序为95℃5min；随后进行30个95℃30s，50℃35s，72℃45s的循环；最后72℃延伸10min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了235bp的特异性条带，则说明该样品存在牛流行热病毒；如果样品没有扩增出235bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛流行热病毒。
7、特异性检测
以提取的试验株和对照株的基因组rna/dna（rna先进行反转录为cdna）进行pcr扩增，检验pcr方法的特异性。
8、敏感性检测
将牛流行热病毒的rt-pcr扩增的目的片段与pmd-18t载体连接，转化大肠杆菌dh5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经pcr鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度后，用rna-freewater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行pcr扩增，进行敏感性检测。
9、重复性检测
用8.01×101ng/μl、8.01×100ng/μl、8.01×10-1ng/μl、8.01×10-2ng/μl、8.01×10-3ng/μl、8.01×10-4ng/μl、8.01×10-5ng/μl和8.01×10-6ng/μl的重组质粒标准样品同时进行pcr，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
10、临床样品检测
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组rna，使用建立的rt-pcr方法进行扩增。
实施例2快速检测牛流行热病毒rt-pcr方法的退火温度试验
分别对退火温度47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃进行rt-pcr扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性大，在退火温度为47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。为此，本pcr方法使用的反应程序为：95℃5min；随后进行30个95℃30s，50℃35s，72℃45s的循环；最后72℃延伸10min。
实施例3检测牛流行热病毒rt-pcr方法的特异性检测结果
提取牛流行热病毒、溶血性曼氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型，使用优化好的反应体系和反应程序进行rt-pcr/pcr扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有牛流行热病毒样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，7株对照株反应管和水对照反应管均未检测到扩增条带，为阴性结果（图2），表明本方法具有很好的特异性。
实施例4检测牛流行热病毒rt-pcr方法的的敏感性检测结果
牛流行热病毒rt-pcr扩增的目的片段与pmd-18t载体连接，转化大肠杆菌dh5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经pcr鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起起始浓度后，用rna-freewater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行pcr扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的pcr检测方法最低检测限为8.01×10-4ng/μl（图3）。
实施例5牛流行热病毒rt-pcr方法的准确性和稳定性检测结果
用8.01×101ng/μl、8.01×100ng/μl、8.01×10-1ng/μl、8.01×10-2ng/μl、8.01×10-3ng/μl、8.01×10-4ng/μl、8.01×10-5ng/μl和8.01×10-6ng/μl的标准样品同时进行pcr扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的rt-pcr检测方法重复性好、稳定性高。
实施例6牛流行热病毒rt-pcr方法的初步应用
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用dna/rna提取试剂盒（cw0548s，北京康为世纪生物科技有限公司）提取组织样品的病原基因组rna，再使用反转录试剂盒hifiscriptcdnasynthesiskit（cw2569m，北京康为世纪生物科技有限公司）将rna反转录为cdna，按试剂盒说明书进行，以此为模板，使用建立的pcr方法进行扩增。结果显示，有7份样品检测出牛流行热病毒的特异性条带，为阳性结果（图4展示了19份样品的检测结果）。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒
<141>2018-05-30
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>1
ctgtaggtgcaatagtcacaa21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>2
aagaacctatcatcaccgatt21