一种检测猪圆环病毒3型实时定量LAMP引物、试剂盒及应用的制作方法

文档序号:15457621发布日期:2018-09-15 01:34

技术领域
本发明涉及微生物检测
技术领域
,具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
:圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科,是目前已知脊椎动物病毒中最小的一种。猪是圆环病毒的主要宿主,各种年龄的猪对圆环病毒均有较强易感性。胚胎期或生后早期感染的猪,往往在断奶后才发病,一般集中在5周龄~18周龄,尤其在6周龄~12周龄最多见。怀孕母猪感染圆环病毒后,导致繁殖障碍,并可经胎盘垂直传染给仔猪。感染猪可自鼻液、粪便等排泄物中排出病毒,经消化道、呼吸道引起感染。圆环病毒3型(PCV3)引起的感染尤为严重,可造成严重的繁殖障碍,导致母猪发情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产弱仔等,给养猪业带来严重威胁和巨大的经济损失。对圆环病毒3型(PCV3)的快速准确诊断是临床上防治猪圆环病毒3型(PCV3)的关键。目前实验室诊断PCV的方法大致可分为2类:①病毒的分离与鉴定;②分子生物学方法。病毒分离与鉴定具有结果准确可靠的特点,多用于急性病例的确诊和新疫区的确定,但此方法需要多次操作程序,影响因素较多,且费时费力,不适于此病的快速诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR,虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确,但需要昂贵的仪器设备,成本较高,在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳,容易造成实验室污染导致出现假阳性结果,也不适合基层和现场检测。技术实现要素:本发明的目的是为了解决实验室检测鉴别猪圆环病毒3型困难、耗时长和仪器昂贵等问题,提供一种简便、快捷准确地定量检测猪圆环病毒3型的LAMP引物、试剂盒及应用,为实现本发明目的所使用的技术方案为:一种检测猪圆环病毒3型的实时定量LAMP引物,所述LAMP引物如SEQIDNO:1~6所示,具体的引物序列如下:SEQIDNO:1(PCV3-F3):TCCAGTTTTTTCCGGGACATSEQIDNO:2(PCV3-B3):AACACTTGGCTCCAAGACGSEQIDNO:3(PCV3-FIP):CTTTTTCTCCAGACCCACCCCAAAAGCAGTGCTCCCCATTGSEQIDNO:4(PCV3-BIP):TTCCCGCCAGAATTGGTTTGGGGCGGAAAGTTCCACTCGTAASEQIDNO:5(PCV3-LF):ACACATATGACCCCACCGTSEQIDNO:6(PCV3-LB):GGTGAAGTAACGGCTGTGTTT。优选的,所述的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2序列可用于PCR检测,用于PCR检测的引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为外引物F3和B3,其扩增片段大小为237bp。本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的实时定量LAMP试剂盒,所述的试剂盒包括具有SEQIDNO:1~6所示核苷酸序列的引物。优选的,所述的试剂盒还包括2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、超纯水和猪圆环病毒3型DNA模板。优选的,所述的猪圆环病毒3型DNA模板是提取自猪圆环病毒3型细胞培养物,是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取。本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的实时定量LAMP试剂盒的应用,具体步骤包括:(1)样品准备(2)LAMP引物的设计与合成(3)病毒基因组DNA模板的提取(4)LAMP反应体系建立(5)LAMP检测方法。优选的,所述的样品准备包括试验毒株、菌株复壮培养,临床组织样品采集,试剂配制。优选的,所述的LAMP反应体系建立以25μl计,2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLSEQIDNO:15pmolSEQIDNO:25pmolSEQIDNO:340pmolSEQIDNO:440pmolSEQIDNO:525pmolSEQIDNO:625pmol猪圆环病毒3型DNA模板2μL超纯水补足25μL。优选的,所述LAMP检测方法的反应温度为63℃,反应在12-15min出现扩增。优选的,所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和定量检测的方法本发明的实质性特点和进步是:1)特异性强所检测的对照病毒和水对照均无阳性结果出来,与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。2)灵敏度高普通PCR检测方法的灵敏度为4.39×10-2ng/μL,而使用本发明的LAMP检测方法,检测限约为4.39×10-4ng/μL,是普通PCR的100倍。3)迅速获得结果普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果,目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后,须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果,从病毒基因组DNA提取到获取试验结果,需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在12分钟左右出现扩增,60分钟内即可完成扩增,且结果判读方式简便,依据反应管浊度值的变化情况即可判断结果,扩增反应结束即可获得试验结果,不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果,从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4)准确性高本LAMP方法检测敏感度比常规PCR方法高,因此在鉴定结果更为准确。此外,目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入,但显色法只能是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应,观察是否有显色来判读试验结果,或者通过跑电泳的方法进行结果判定,无法区分特异性扩增与非特异性扩增,因此增加了假阳性诊断结果的几率;而且对于弱阳性反应,通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性,本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况,能够避免上述的缺陷,具有更高的准确性。5)不造成污染常规的LAMP方法在反应结束后通过凝胶电泳的方法来判读结果,或者开盖加入荧光染料进行判断,增加了试验成本、耗时间,凝胶电泳使用的染料对环境也造成污染,且打开反应管容易造成实验室气溶胶污染。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况,反应结束即可获得结果,不需要打开反应管的盖子,能有效避免气溶胶污染。6)可实时定量本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果,不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系,由此绘制标准曲线,获得标准曲线方程,即可进行定量检测。附图说明图1是本发明的LAMP方法特异性检测结果,其中1:猪圆环病毒3型、2:猪圆环病毒2型、3:猪瘟病毒、4:蓝耳病毒、5:伪狂犬病毒、6:猪支原体、7:水对照;结果显示,只有猪圆环病毒3型反应管出现浊度的上升曲线,5株对照反应管和水对照反应管均无扩增。图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪圆环病毒3型敏感性检测的结果;其中1:4.39×101ng/μL、2:4.39×100ng/μL、3:4.39×10-1ng/μL、4:4.39×10-2ng/μL、5:4.39×10-3ng/μL、6:4.39×10-4ng/μL、7:4.39×10-5ng/μL、8:4.39×10-6ng/μL;结果显示本发明的LAMP法检测限约为4.39×10-4ng/μL,而普通PCR方法检测限约为4.39×10-2ng/μL。图4是本发明猪圆环病毒3型定量标准曲线:利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线,代入标准曲线方程,即可求出猪圆环病毒3型拷贝数。具体实施方式下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1建立检测猪圆环病毒3的LAMP方法1、材料的准备猪圆环病毒3型阳性病料来自兽医临床,经广西兽医研究所鉴定,猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒和猪支原体疫苗均为市售疫苗。BstDNA聚合酶购自北京蓝谱生物科技有限公司,货号LMP204;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒,购自康为世纪生物科技有限公司,货号CW0548。2、LAMP引物的设计与合成根据GenBank中的圆环病毒3型的衣壳蛋白编码基因序列,设计特异性LAMP引物,其中F3、B3为外引物,FIP、BIP为内引物,LF和LB为环引物,其中SEQIDNO:1(PCV3-F3):TCCAGTTTTTTCCGGGACATSEQIDNO:2(PCV3-B3):AACACTTGGCTCCAAGACGSEQIDNO:3(PCV3-FIP):CTTTTTCTCCAGACCCACCCCAAAAGCAGTGCTCCCCATTGSEQIDNO:4(PCV3-BIP):TTCCCGCCAGAATTGGTTTGGGGCGGAAAGTTCCACTCGTAASEQIDNO:5(PCV3-LF):ACACATATGACCCCACCGTSEQIDNO:6(PCV3-LB):GGTGAAGTAACGGCTGTGTTT。3、病毒基因组DNA提取使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,货号CW0548)提取猪圆环病毒3型、对照病毒的基因组DNA/RNA,以及组织样品的病毒基因组DNA。4、LAMP反应体系建立按照试剂盒说明书,按25μl体系配置:2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLF35pmolB35pmolFIP40pmolBIP40pmolLF25pmolLB25pmolPCV3DNA2μL超纯水补足25μL。LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C,日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况,反应温度为63℃,反应时间为60min。5、LAMP检测方法1)特异性检测以猪圆环病毒3型,以及对照毒株猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒、猪支原体的基因组DNA/RNA,作为LAMP反应的模板,同时以水作为空白对照,检验LAMP方法的特异性。2)敏感性检测以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物,将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T,转化大肠杆菌感受细胞DH5a,氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌,提取重组的质粒DNA,经测序确认后,测定重组质粒的起始浓度,作为标准样品,用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释8个稀释度,取各稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增,对比两种检测方法的敏感性3)定量检测设置对照:浓度为1:4.39×101ng/μL;2:4.39×100ng/μL;3:4.39×10-1ng/μL;4:4.39×10-2ng/μL;5:4.39×10-3ng/μL;6:4.39×10-4ng/μL的重组质粒标准样品各一个,因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系,所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间(如表1)做成标准曲线,获得标准曲线方程,即可对未知样品的基因拷贝数进行定量检测。实施例2LAMP检测方法的特异性结果对1株猪圆环病毒3型、5株对照病毒和水对照进行LAMP扩增,结果如图1所示,猪圆环病毒3型反应管在12分钟左右出现浊度的上升曲线,为阳性结果,5株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现,为阴性结果。实施例3LAMP检测方法的敏感性结果猪圆环病毒3型的重组质粒起始浓度为4.39×10ng/μL,用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释8个稀释度,取各稀释度2μL作为模板,结果如图2和图3所示,结果显示本发明的LAMP法检测限约为4.39×10-4ng/μL,而普通PCR法检测限为4.39×10-2ng/μL。实施例4猪圆环病毒3型定量标准曲线的绘制设置对照:浓度为1:4.39×101ng/μL;2:4.39×100ng/μL;3:4.39×10-1ng/μL;4:4.39×10-2ng/μL;5:4.39×10-3ng/μL;6:4.39×10-4ng/μL的重组质粒标准样品各一个,因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系,所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间(如表1)做成标准曲线,获得标准曲线方程,y=0.509x-7.083,如图4所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.993,呈良好的线性关系。以时间为X值,可求出Y值即浓度的负次方数,则浓度为10-y,再乘以基数4.39,即为4.39×10-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=(6.02×1023×(ng/ul×10-9))/(DNAlength×660),DNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小,为2693+237=2930bp,将其换算成拷贝数(copies/μL):6.02×1023×(2.05×10-y×10-9)/(2930×660),简化为:6.38×108×10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为20分钟时,带入所建立的标准曲线方程,求出Y等于3.097,则拷贝数为6.38×108×10-3.097,即为6.38×104.903copies/μL,从而达到定量的效果。表1时间(min)12.413.515.717.719.921.8标准值(-LOG)-101234以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。序列表<110>广西壮族自治区兽医研究所<120>一种检测猪圆环病毒3型的实时定量LAMP引物、试剂盒及应用<141>2018-05-30<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>1tccagttttttccgggacat20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>2aacacttggctccaagacg19<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>3ctttttctccagacccaccccaaaagcagtgctccccattg41<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>4ttcccgccagaattggtttggggcggaaagttccactcgtaa42<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>5acacatatgaccccaccgt19<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialsequenceLatin)<400>6ggtgaagtaacggctgtgttt21当前第1页1 2 3 
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