一种检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白cagA的LAMP引物组及其应用的制作方法

文档序号:15457518发布日期:2018-09-15 01:32

本发明属于生物学技术领域,更具体地说,尤其涉及一种检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白cagA的LAMP引物组及其应用。



背景技术:

长期感染HP会提高胃部疾病的发生率,尤其是慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃部恶性肿瘤等,1994年,世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将其列为Ⅰ类致癌因子。但并非所有携带HP的患者都会发病。研究显示,含有细胞毒素相关蛋白A基因(cagA)的HP菌株具有更强的致病性。细胞毒素相关蛋白A(CagA)由cagA基因编码,是HP主要毒力因子。CagA进入胃上皮细胞后,可以与细胞内多种蛋白反应,使胃内细胞功能紊乱,甚至使胃上皮细胞发生病变,从而致病。各项研究指出CagA与十二指肠溃疡、验证和胃癌等肠道疾病关系密切。

此外HP分型检测很困难,因为它可能在宿主体内潜伏很长时间,且不表现出任何症状。目前采用最多的检测方法有:组织病理检查、C13/C14半衰期检查、血清学检测以及PCR反应等,这些方法对仪器要求较高、检测时间长、灵敏度不够且很难做到毒株分型。

针对于此,我们建立了一种灵敏度高、特异性强、操作简单、用时短、成本低,且能准确对HP毒株进行毒性分型的检测方法。该方法基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),在60℃左右水浴10-30 min就可以进行核酸扩增,获得准确的HP分型结果。LAMP整个反应在水浴锅中就可进行,不需要复杂的仪器,且反应中利用多对引物同时进行扩增,特异性强。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白cagA的LAMP引物组及其应用,以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白cagA的LAMP引物组,所述LAMP引物组包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LF/LB。

一种幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(cagA)的恒温扩增检测方法,具体包括以下步骤:

S1、所述LAMP引物组包括一对内引物FIP/BIP、一对外引物F3/B3和一对环引物LF/LB组成,引物序列如下:

FIP:TGCAATTTTGTTAATCCGGTCAATTTGAGTGYAAAAATTGACCAAC

BIP:GTTTCAGTGGAGYRGGGCRATGCTTGATTKGYMTCATCA

F3:GCTCAARTTGCYAAAAAGG

B3:CRCTTCTYCTMARAGGGAAG

LF:ATTGCTGATGTAGCTTCGTTGA

LB:KCAGCTAGCCCTGAACCC

三对引物最优比例为8:8:1:1:4:4;

S2、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(cagA)的LAMP反应体系建立:

反应液:1×ThermoPol反应缓冲液;6 mM MgSO4;0.8 M 甜菜碱;1.4 mM dNTPs;以上三对引物,0.2 μM F3/B3;1.6 μM FIP/BIP ;0.8 μM LF/LB;Bst DNA聚合酶320 U/mL;待测DNA样本1 μL;无酶水补足至20 μL;

S3、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(cagA)的LAMP反应条件:

将配置好的反应体系放入64 ℃水浴锅中,水浴30 min,95℃水浴5 min使酶失活;

S4、结果判断:

LAMP产物电泳观察,有梯状条带为阳性,无梯状条带为阴性。

本发明的技术效果和优点:

(1)操作简单:完成反应只需要一台水浴锅和一个电泳仪,不需要复杂的仪器和专业的操作人员;

(2)快速高效:反应仅需30 min;

(3)特异性强:针对cagA基因设置3对引物,充分囊括了整个基因序列,三重保障使得针对性极强,通过其他11种菌株DNA验证,发现均无假阳问题;

(4)灵敏度高:最低检测限为100 fg DNA。

附图说明

图1为检测限测试电泳图,为cagALAMP体系扩增不同浓度HP菌株ATCC 700392 DNA 电泳图,NC为无DNA空白对照;

图2为温度优化电泳图,为cagA LAMP体系在不同浓度下扩增HP菌株ATCC 700392 DNA电泳图,NC为无DNA空白对照;

图3为时间优化电泳图,为cagA LAMP体系在扩增HP菌株ATCC 700392 DNA反应不同时间电泳图,NC为无DNA空白对照;

图4为特异性电泳图,为cagA LAMP体系在扩增HP菌株ATCC 700392 DNA以及其他菌株DNA电泳图反应电泳图,“0”泳道为HP菌株ATCC 700392 DNA ,“1-11”泳道分别为金黄色葡萄球菌金黄亚种ATCC 29213;表皮葡萄球菌CMCCB 26069;粪肠球菌CICC 10396;无乳链球菌CICC 10465;屎肠球菌CICC 21605;肺炎链球菌CMCCB 31001;大肠埃希氏菌CMCC 44102;鲍曼不动杆菌CICC 22933;肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种CMCCB 46120;铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785;阴沟肠杆菌CICC 21539 DNA,“NC”泳道为无DNA空白对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1

幽门螺杆菌中细胞毒素相关蛋白(cagA)检测限测试

分别以HP菌株ATCC 700392 DNA 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL为模板。

LAMP反应体系包括:1×ThermoPol反应缓冲液;6 mM MgSO4;0.8 M 甜菜碱;1.4 mM dNTPs;以上三对引物,0.2 μM F3/B3;1.6 μM FIP/BIP;0.8 μM LF/LB;Bst DNA聚合酶320 U/mL;DNA模板1 μL,无酶水补足至20 μL。空白对照组不加DNA,加入相应1 μL无酶水。

水浴锅64℃分别反应30 min,然后95℃反应5 min使酶失活。反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳,出现梯形条带为有LAMP反应,无梯形条带即为未反应。

检测限测试结果:HP菌株在≥100 fg DNA模板下,反应产物电泳均有明显梯形条带,在<100 fg时无条带。表明本专利设计的cagA LAMP检测体系的检测限为100 fg。

实施例2

幽门螺杆菌中细胞毒素相关蛋白(cagA)反应温度优化

以HP菌株ATCC 700392 DNA 1 ng为模板。

LAMP反应体系包括:1×ThermoPol反应缓冲液;6 mM MgSO4;0.8 M甜菜碱;1.4 mM dNTPs;以上三对引物,0.2 μM FIP/BIP;1.6 μM F3/B3;0.8 μM LF/LB;Bst DNA聚合酶320 U/mL;DNA模板1 μL,无酶水补足至20 μL。空白对照组不加DNA,加入相应1 μL无酶水。

水浴锅60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃分别反应30 min,然后95℃反应5 min使酶失活。反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳,出现梯形条带为有LAMP反应,无梯形条带即为未反应。

反应温度优化结果:HP菌株DNA在60-68℃反应产物电泳均有明显梯形条带,在70℃时候条带不明显或者完无条带,基本没有LAMP反应。表明本专利设计的cagA体系反应适合温度为60-68℃,其中64℃为最适温度。

实施例3

幽门螺杆菌中细胞毒素相关蛋白(cagA)反应时间优化

以HP菌株ATCC 700392 DNA 1ng为模板。

LAMP反应体系包括:1×ThermoPol反应缓冲液;6 mM MgSO4;0.8 M甜菜碱;1.4 mM dNTPs;以上三对引物,0.2 μM F3/B3;1.6 μM FIP/BIP;0.8 μM LF/LB;Bst DNA聚合酶320 U/mL;DNA模板1 μL,无酶水补足至20 μL。空白对照组不加DNA,加入相应1 μL无酶水。

水浴锅63℃分别反应10 min,20 min,30 min,40 min,50 min,60 min,然后95℃反应5 min使酶失活。反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳,出现梯形条带为有LAMP反应,无梯形条带即为未反应。

反应时间优化结果:HP菌株DNA LAMP反应≥20 min的产物均有明显梯形条带,表明本专利设计的cagA体系最低反应时间为20 min。

实施例4

幽门螺杆菌中细胞毒素相关蛋白(cagA)基因引物设计及特异性验证

以HP菌株ATCC 700392 DNA 1 ng以及其他11种人体肠道常见菌株(金黄色葡萄球菌金黄亚种ATCC 29213;表皮葡萄球菌CMCCB 26069;粪肠球菌CICC 10396;无乳链球菌CICC 10465;屎肠球菌CICC 21605;肺炎链球菌CMCCB 31001;大肠埃希氏菌CMCC 44102;鲍曼不动杆菌CICC 22933;肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种CMCCB 46120;铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785;阴沟肠杆菌CICC 21539)DNA为模板。

LAMP反应体系包括:1×ThermoPol反应缓冲液;6 mM MgSO4;0.8 M甜菜碱;1.4 mM dNTPs;以上三对引物,0.2 μM F3/B3;1.6 μM FIP/BIP;0.8 μM LF/LB;Bst DNA聚合酶320 U/mL;DNA模板1 μL,无酶水补足至20 μL。空白对照组不加DNA,加入相应1 μL无酶水。

水浴锅63℃反应30 min,95℃反应5 min使酶失活。反应产物以2%琼脂糖凝胶电泳,出现梯形条带为阳性,未出现条带为阴性。

引物特异性验证结果:HP菌株DNA LAMP产物电泳有梯形条带,为阳性;其他菌株DNA LAMP产物电泳无梯形条带。表明所设计的引物特异性好,能将HP cagA菌株与其他菌株区分开来。

综上所述,与现有技术相比,本发明:

(1)操作简单:完成反应只需要一台水浴锅和一个电泳仪,不需要复杂的仪器和专业的操作人员;

(2)快速高效:反应仅需30 min;

(3)特异性强:针对cagA基因设置3对引物,充分囊括了整个基因序列,三重保障使得针对性极强,通过其他11种菌株DNA验证,发现均无假阳问题;

(4)灵敏度高:最低检测限为100 fg DNA。

最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

再多了解一些
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