本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断rsv感染的环状rna及其应用。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,rsv)是引起婴幼儿、免疫力低下人群及老年人下呼吸道感染最主要病毒病原体之一，是导致婴幼儿住院的首要病因，全球每年约有16万例婴幼儿死于rsv相关的下呼吸道感染，医疗花费巨大。目前，除支持治疗以外，尚无特异性rsv疾病的治疗方案，也没有研制成功的预防该病毒感染的rsv疫苗可以有效减少疾病发生率。
随着高通量测序技术的飞速发展，数以万计的非编码转录产物不断被发现。研究表明，人类仅有1％～2％的基因组序列具备蛋白编码功能，而不具备蛋白质编码能力的非编码区竟高达98％以上，提示人体内有大量非编码rna产生。环状rna(circularrna,circrna)是一类以共价闭合环为特征，不含有5’端帽子和3’端polya尾巴的非编码rna分子。由于circrna没有游离末端，使它们对rna核酸外切酶存在一定的抵抗性。最新研究发现，circrna作为非编码rna的新成员，与多种疾病的发生发展密切相关，是一种充满前景的生物标记物和治疗靶点。
研究发现，抗病毒基因zc3hav1基因编码合成的锌指抗病毒蛋白(zap)，又称为多聚合酶-13(parp13)，是细胞对应激反应的重要组成部分；zap通过与病毒rna中的zap反应元件(zre)相互作用，以及通过动员外泌体来降解rna底物，抑制多种rna病毒(包括逆转录病毒、α病毒和丝状病毒)的复制。目前，对于人类抗病毒基因zc3hav1产生的环状rna还未见报道，rsv病毒感染引起的环状rna的表达变化亦未见报道。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于诊断rsv感染的试剂盒，能快速诊断rsv感染，具有简便、快捷、灵敏度和特异性高等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于诊断rsv感染的试剂盒，包含检测circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna的表达量的试剂。
优选地，所述试剂包括扩增所述环状rna的引物。
优选地，所述引物的核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
优选地，所述试剂盒还包含rna提取试剂、cdna逆转录试剂和荧光染料。
人类zc3hav1基因可反向剪切产生多个环状rna(已收录15个)，其中包括本发明所述的circbaseidhsa_circ_0082626的环状rna。所述环状rna长度为1564bp的环状rna，序列如seqidno.1所示。
seqidno.1:5’-gaatttatgcaaatattctcatgaggttctctcagaagagaacttcaaagtcctgaaaaatcacgaactctctggactgaacaaagaggaattagcagtgctcctcctccaaagtgatcctttttttatgcccgagatatgcaaaagttataagggagagggtcggcagcagatttgtaaccagcagccaccgtgttcaagactccacatctgtgaccacttcacccgagggaactgtcgttttcccaactgcctccggtcccataacctgatggacagaaaggtgctggccatcatgagggagcacgggctgaaccccgacgtggtccagaacatccaggacatctgcaacagcaagcacatgcagaagaatcccccagggcccagagctccttcttcacatcgtagaaacatggcatatagggctagaagcaagagtagagatcggttctttcagggcagccaagaatttcttgcgtctgcttcagcgtctgctgagaggtcctgcacacctagtccagatcagatcagccacagggcttccctggaggacgcgcctgtggacgatctcacccgcaagttcacgtatctggggagtcaggatcgcgctcggcctccctcaggctcgtccaaggctactgatcttggaggaacaagtcaggccgggacaagccagaggtttttagagaacggcagtcaagaggacctcttgcatggaaatccaggcagcacttaccttgcttccaattcaacatcagcccccaactggaagagcctcacatcctggacgaatgaccaaggcgccaggagaaagactgtgttttctcccacgctacctgccgcccgctcttctcttggctctctgcaaacacctgaagctgtgaccaccagaaagggcacaggcttgctttcctcagactacaggatcatcaatggcaaaagtggaactcaggacatccagcctggccctctttttaataataatgctgatggagtggccacagatataacttctaccagatccttaaattacaaaagcactagcagcggtcacagagaaatatcatcacctaggattcaggatgctggacctgcttcccgagatgtccaggccactggcagaatcgcagatgatgctgacccaagagtagcacttgttaacgattctttatctgatgtcacaagtaccacatcttctagggtggatgatcatgactcagaggaaatttgtcttgaccatctgtgtaagggttgtccgcttaatggtagctgcagcaaagtccacttccatctgccttaccggtggcagatgcttattggtaaaacctggacggactttgagcacatggagacgatcgagaaaggctactgtaaccccggaatccacctctgttctgtaggaagttatacaatcaattttcgggtaatgagttgtgattcctttcccatccgacgcctctccactccttcttctgtcaccaagccagccaattctgtcttcaccaccaaatggatttggtattggaagaatgaatctggcacatggattcagtatggagaagag-3’。
本发明还提供了circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna作为分子标志物在筛选或制备用于诊断rsv感染的试剂中的用途。
本发明所述环状rna作为分子标志物可用于筛选或制备用于诊断rsv感染的试剂。
本发明还提供了检测circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna的试剂在制备用于诊断rsv感染的试剂盒中的用途。
检测所述环状rna的试剂可用于制备用于诊断rsv感染的试剂盒。
优选地，检测所述环状rna的试剂包括扩增所述环状rna的引物。
优选地，所述引物的核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
seqidno.2：5’-cagtatggagaagaggaatt-3’。
seqidno.3：5’-ttttgcatatctcgggcata-3’。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明证实了来源于zc3hav1基因，circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna的存在，并对其特征进行了研究；(2)本申请发明人首次发现circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna在rsv感染的细胞中的表达量显著升高，可以作为rsv感染检测的分子指标，具有简便、快捷、灵敏度和特异性高等优点；(3)本发明提供的检测所述环状rna的引物具有灵敏度高和特异性好等优点。
附图说明
图1为hsa_circ_0082626产生示意图。
图2为hsa_circ_0082626反向剪切位点鉴定结果图，其中，a：电泳结果图；b：序列分析图。
图3为hsa_circ_0082626抵抗rnaser处理实验结果图。
图4为hsa_circ_0082626在细胞中的分布实验结果图。
图5为rsv感染的a549细胞中hsa_circ_0082626的表达结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种用于诊断rsv感染的试剂盒，所述试剂盒包含检测circbaseid为hsa_circ_0082626的环状rna的表达量的引物，所述引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
所述引物通过本领域常规技术合成，按说明配制成母液，可利用ddh2o稀释为工作浓度。
利用所述试剂盒检测所述环状rna的表达量的方法包括以下步骤：
(1)总rna提取：用trizol法抽提总rna。
(2)反转录：利用反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser合成cdna。反应体系为20ul(其中步骤1反应液10ul：5×gdnaeraserbuffer2ul、gdnaeraser1ul、rna和水共7ul；primescriptrtenzymemix1ul；rtprimermix1ul；5×primescriptbuffer4ul；rnasefreedh2o4ul)；反应条件为：rnasefreedh2o4ul；反应条件为：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，∞。
(3)qpcr：利用试剂盒tbgreentmpremixextaqtmii进行qpcr，反应体系为20ul(其中tbgreenpremixextaqii10ul、roxreferencedyeii0.4ul、正反向引物各0.8ul、ddh2o6ul、cdna2ul)；反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，共40个循环。
实施例2
本实施例通过高通量测序证实抗病毒基因zc3hav1产生环状rnahsa_circ_0082626。
方法：利用肺癌细胞a549细胞样品，提取总rna，去除核糖体rna，然后用rnaser酶降，进一步构建文库。构建好的文库用illuminahiseq2500进行rna-seq测序，分析针对抗病毒基因zc3hav1相关的环状rna。
结果：通过分析发现，a549细胞中检测出来源于zc3hav1基因的环状rna，其序列如seqidno.1所示，该环状rna长度为1564bp，在circbase数据库中的收录号为hsa_circ_0082626。
实施例3
本实施例研究hsa_circ_0082626的特征。
(1)hsa_circ_0082626反向剪切位点的pcr扩增验证及测序验证。
方法：根据hsa_circ_0082626序列，设计一对双向引物来扩增包含反向剪切位点的序列，所使用的引物对包括seqidno.2和seqidno.3。以细胞的cdna为模板进行pcr扩增，反应体系为20ul(其中takaralataq0.2ul、10×lataqbuffer2ul、25mmmgcl22ul、dntpmixture3.2ul、cdnatemplate1ul、正反向引物各1.0ul、ddh2o9.6ul)；反应程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共34个循环；72℃延伸10min。pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，送广州艾基生物技术有限公司测序。
结果：序列分析表明，人类zc3hav1基因共包含13个外显子，环状rnahsa_circ_0082626是由6号外显子3’末端反向连接到3号外显子5’端形成(图1)。琼脂糖凝胶电泳表明，成功扩增出包含反向剪接位点的大小为150bp的片段(图2)。测序结果进一步证实hsa_circ_0082626由zc3hav1基因6号外显子反向剪切至3号外显子形成，箭头左端为6号外显子末尾序列，箭头右端为3号外显子的起始序列(图2)。
(2)hsa_circ_0082626抵抗rnaser消化
方法：(1)rna提取：用trizol法抽提出细胞总rna；(2)rnaser处理：rna用量为10ug，每微克rna使用2urnaser(阴性对照组用ddh2o补齐)，37℃孵育10min；(3)rna纯化：rnaser处理后的rna产物用rneasyminelutecleanupkit试剂盒纯化，之后测定rna浓度；(4)rna反转录：用反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser合成cdna，反应条件同实施例1；(5)实时定量pcr：用试剂盒tbgreentmpremixextaqtmii进行qpcr，反应体系共20ul，反应条件同实施例1。
结果：circrna没有游离末端，故circrna对rna核酸外切酶存在一定的抵抗性。本研究中，细胞总rna经rnaser处理后，进一步进行rt-qpcr，检测结果如图3所示，gapdh基因的线性mrna降解最厉害(约为初始量的1/50)，相比之下，hsa_circ_0082626基本上没有被降解，表明hsa_circ_0082626耐受rnaser消化。此实验中，环状rnacdr1as作为阳性对照，与hsa_circ_0082626类似，环状rnacdr1as也耐受rnaser消化。
(3)核质分布实验表明，hsa_circ_0082626主要分布于细胞质
方法：(1)rna提取：收取细胞，使用试剂盒(paristmkit)将胞质、胞核中的rna分离并提取出来，之后进行rna浓度测定；(2)rna反转录：分别取细胞质rna500ng和细胞核rna500ng进行反转录，用反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser合成cdna，反应条件同实施例1；(3)实时定量pcr：用试剂盒tbgreentmpremixextaqtmii进行qpcr，反应体系共20ul，反应条件同实施例1。
结果：分离细胞的胞核、胞质rna后,用qpcr分别检测胞核与胞质中hsa_circ_0082626、u1snrna(u1)、gapdh和cdr1as的相对分布量。已知u1rna主要定位于胞核，gapdhrna主要定位于胞胞质，以u1和gapdh分别作为胞核和胞质定位的参照。实验结果如图4所示：u1和gapdh分别主要位于细胞核和细胞质，提示本实验胞核、胞质rna分离成功；hsa_circ_0082626在细胞质中的表达量显著高于细胞核(胞质与胞核rna含量比值约为8)；与hsa_circ_0082626类似，对照环状rnacdr1as也主要分布于细胞质，与其他研究报道相符。
实施例4
本实施例研究rsv感染的肺癌细胞中hsa_circ_0082626的表达情况。
(一)实验方法
1、用hep2细胞制备和滴定rsv病毒，制备的rsv病毒滴度为1.9*108pfu/ml：rsv病毒感染能引起hep2细胞裂解性病变，故使用空斑法对病毒进行滴定。
2、用滴定好的rsv病毒感染a549细胞(moi＝1)：即病毒量与细胞数的比值为1。
3、分别于感染的24小时和48小时收集细胞样品，利用实施1所述试剂盒和方法检测细胞中hsa_circ_0082626的表达。
(二)实验结果
结果如图5所示，相比于对照未感染组(mock),rsv感染组的细胞中，hsa_circ_0082626的表达明显升高；其中，rsv感染24小时和48小时hsa_circ_0082626的表达量分别约为对照组的5倍和10倍。结果表明，rsv感染可显著上调hsa_circ_0082626的表达，提示hsa_circ_0082626可作为诊断rsv感染的分子标志物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
sequencelisting
<110>广州医科大学附属第五医院
<120>一种用于诊断rsv感染的环状rna及其应用
<130>2018.5.25
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<213>智人（homosapiens）
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