一种预测药物疗效的方法与流程

本发明是关于一种预测药物疗效的方法。

背景技术

个体对于药物反应的差异性会使许多疾病的治疗方式复杂化，即使在一同质性高的群体中(譬如同性别或年龄近似等)，有些个体对某一特定药物有良好反应，而其他个体对于该特定药物却会反应不良。

在对病患施予化疗之前预测该化疗的效果可有助于改善该病患的化疗反应、减少毒性与照护费用，因而提供该病患一量身订做的治疗方案。化疗敏感性测试(chemosensitivityassays)是指在实验室中所进行的专门用于分析某一已知化疗药物对于抑制肿瘤生长之功效的任何生体外(invitro)测试。理想的生体外化疗敏感性测试应具有可重复性与可使用少量组织，而其临床反应预测结果应为快速而准确。各种化疗敏感性测试与抗药性测试(resistanceassay)虽已被发展出来，但因成功率低、定义生体外敏感性的标准含糊、过长的检验报告时间(turnaroundtime)以及缺少测试指引疗法(assay-guidedtherapy)与经验疗法(empiricaltherapy)的试验比较，因而极少被证明能利用于临床实务上。

在生物细胞领域中，通常认为三维细胞培养的仿生活性(biomimeticactivity)会比单层二维细胞培养的更佳，也因此目前已有数种三维细胞培养方式被发展出来，例如基底膜基质法(matrigel)、水合胶法(hydrogel)、悬浮法(suspension)、悬滴培养法(hangingdropculture)、微团块培养法(micromassculture)以及非黏附性基质法(non-adherentsubstrate)等。而在细胞培养学领域中，使用生物支架(scaffold)的重要性在于为了使所培养的细胞能生长成为具有意欲的功能与形态；生物支架的功能在于提供适于细胞生长的三维框架，一般称为三维生物支架(three-dimensionalscaffold)；此类三维生物支架为多孔性，作为植入细胞、细胞附着(cellattachment)、并导引细胞于三维空间上生长分化之用，目的为产生仿真与组织或器官之再生。

传统的二维平面细胞培养方式，细胞间彼此相接触的面积很小，细胞表面积约有一半接触细胞培养盘，另一半则接触培养基；而三维的细胞培养环境则有以下好处：能提供较佳的指示细胞功能的生化信息、容许细胞于生物支架内移动(migration)、增加细胞密度并增加细胞间的信号传输(signaltransmission)、提供细胞附着分子和诱发细胞分化的分子。当海绵体状的三维生物支架其孔隙的孔径大于50微米(μm)时，细胞移动增强，所植入的细胞与养分的分布也因互相链接的孔隙结构而更平均。

对于一药物的效果或是个体对于治疗方案的反应，现今仍需要更有效的预测方法。医生或医学专家藉由这样的预测方法可以快速判断某一药物或治疗方案对于一特定个体是否具有疗效，可因此减少该个体的病痛与治疗花费，同时，也可降低或消除该个体被投予无效药物或治疗方案的机会，并因此减少不良副作用的可能性。

技术实现要素：

除非上下文另有明确说明，否则本说明书以及申请专利范围中所使用的单数形式「一」及「该」包含复数个体及物。

本说明书以及申请专利范围中所使用的「药物」一词为包含一或多种以上的药物组合，及使用一或多种以上药物组合的治疗方案(treatmentregimen)。

本说明书以及申请专利范围中所使用的「海绵体」(sponge)一词为包含任何形状、大小或组成的三维立体结构，可植入至少一种细胞，作为细胞附着、细胞黏附、并作为促进细胞正常生长、及/或增生及/或分化之用。

于一实施例中，本发明的海绵体为由纤维素(cellulose)所组成；由于该纤维素海绵体(cellulosesponge)是藉由本发明所揭示的方法制备而成并作为医药之用，因此较佳地，该纤维素海绵体具有生物兼容性。

于一实施例中，本发明的纤维素海绵体可作为细胞培养之用，而该纤维素海绵体具有高度透气性及养分可渗透性，亦即该纤维素海绵体具有较佳的比表面积(specificsurfacearea)。

于一实施例中，培养于本发明的纤维素海绵体上的细胞种类可为任何天然取得的细胞、或人为进行生物工程处理的细胞或上述两者再经繁殖所得者，使用上并无特别的限制。

本说明书中所使用的「起始剂」(initiator)一词，乃指一类易因受热或受光而分解，进而产生自由基而引发聚合反应的化合物。该起始剂不但可引发自由基引致的聚合反应及不饱和链单体聚合的共聚合反应，此外，也可用于不饱和多体的交联反应(cross-linking)。

本说明书以及申请专利范围中所使用的「类器官」(organoid)一词，为生体外(invitro)产生的一种器官的微型与简化形态，三维的结构可显示真实的微解剖结构。类器官是由来源组织的单一或一些细胞衍生而来，可于三维培养环境中自我组织。

本发明提供了一种预测用于治疗癌症的药物的疗效的方法，该方法包含：(a)从一罹患癌症的个体得到一多种细胞团簇(multicellularcluster)，该多种细胞团簇包含一癌细胞；(b)将该多种细胞团簇培养于一纤维素海绵体上；(c)投予药物于该培养的多种细胞团簇；(d)测量该癌细胞于投予药物前的第一存活率，并测量该癌细胞于投予药物后的第二存活率，当该第二存活率比该第一存活率低时，此方法即预测该药物对于该罹患癌症的个体有正向效果。

依据本发明的预测方法，于一实施例中，该药物为化疗剂。

依据本发明的预测方法，于一实施例中，该化疗剂为顺铂(cisplatin)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。

依据本发明的预测方法，于一实施例中，该癌症为大肠直肠癌。

依据本发明的预测方法，于一实施例中，该多种细胞团簇(multicellularcluster)形成一类器官(organoid)。

本发明并提供了一种预测药物疗效的方法，该方法包含：(a)从一患病的个体得到一多种细胞团簇(multicellularcluster)，该多种细胞团簇包含病变的细胞；(b)将该多种细胞团簇培养于一纤维素海绵体上；(c)投予药物于该培养的多种细胞团簇；(d)测量该病变的细胞于投予药物前的第一存活率，并测量该病变的细胞于投予药物后之第二存活率，当该第二存活率比该第一存活率低时，此方法即预测该药物对于该患病的个体有正向效果。

依据本发明的预测方法，于一较佳实施例中，该病变的细胞为癌细胞。

依据本发明的预测方法，于一较佳实施例中，该药物为化疗剂。于一更佳实施例中，该化疗剂为顺铂(cisplatin)与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-fu)。

依据本发明的预测方法，于一较佳实施例中，该患病的个体为大肠直肠癌患者。

依据本发明的预测方法，于一较佳实施例中，所培养的多种细胞团簇形成一类器官(organoid)。

依据本发明的预测方法，于一实施例中，制备该纤维素海绵体的方法包括：(a)提供一羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)溶液，该羟丙基纤维素溶液含有一可自我交联(self-crosslinkable)而形成化学键的取代基；(b)将该含有可自我交联而形成化学键的取代基的羟丙基纤维素溶液以伽马射线(γ-ray)照射以产生交联反应；其中，制备该含有可自我交联而形成化学键之取代基的羟丙基纤维素溶液的方法包括：(a)将羟丙基纤维素溶解于二甲基甲酰胺(dimethylformamide，dmf)中以形成一羟丙基纤维素溶液；(b)将一包含可自我交联而形成化学键之取代基的化合物溶解于dmf中以形成一溶液，将该溶液缓慢逐滴地加入步骤(a)的羟丙基纤维素溶液；(c)加入一醇类以产生反应；(d)于室温下反应并自然干燥，形成该含有可自我交联而形成化学键之取代基的羟丙基纤维素。

依据本发明的预测方法，于另一实施例中，制备该纤维素海绵体的方法包括：(a)提供一羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)溶液，该羟丙基纤维素溶液含有一可自我交联(self-crosslinkable)而形成化学键之取代基；(b)加入一起始剂与一催化剂于该含有可自我交联而形成化学键之取代基的羟丙基纤维素溶液中以产生交联反应；其中，制备该含有可自我交联而形成化学键之取代基的羟丙基纤维素溶液的方法包括：(a)将羟丙基纤维素溶解于二甲基甲酰胺(dimethylformamide，dmf)中以形成一羟丙基纤维素溶液；(b)将一包含可自我交联而形成化学键之取代基的化合物溶解于dmf中以形成一溶液，将该溶液缓慢逐滴地加入步骤(a)之羟丙基纤维素溶液；(c)加入一醇类以产生反应；(d)于室温下反应并自然干燥，形成该含有可自我交联而形成化学键之取代基的羟丙基纤维素。

依据该制备纤维素海绵体的方法，于一实施例中，该包含可自我交联而形成化学键之取代基的化合物包括但不限于：异氰酸烯丙酯(allylisocyanate)、甲基丙烯酸(methacrylicacid)、丙烯酸(acrylicacid)或甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidylmethacrylate)。

依据该制备纤维素海绵体之方法，于一实施例中，该醇类的体积为dmf总体积的1.5-50％。于另一实施例中，该醇类的体积为dmf总体积的7.5-40％。而于另一实施例中，该醇类的体积为dmf总体积的10-35％。

依据该制备纤维素海绵体的方法，于一实施例中，该醇类包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇与丁醇。

依据该制备纤维素海绵体的方法，于一实施例中，该起始剂为过硫酸盐(persulfate)起始剂；而该催化剂为有机胺类(organicamine)催化剂。于另一实施例中，该过硫酸盐起始剂包括但不限于：过硫酸钠、过硫酸铵或过硫酸钾；而该有机胺类催化剂包括但不限于：n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(n,n,n’,n’-tetramethylethylenediamine,temed)、n,n,n’,n’-四(2-羟基丙基)乙二胺(n,n,n’,n’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine，tkhed)、n,n,n’,n’-四甲基-3-(10h-酚噻嗪(phenothiazin)-10-yl-1,2-丙二胺(propanediamine)(n,n,n’,n’-tetramethyl-3-(10h-phenothiazin-10-yl)-1,2-propanediamine)、n,n,n’,n’-四甲基朴瑞根(tetramethylpregn)-5-烯-3β,20α-二胺(n,n,n’,n’-tetramethylpregn-5-ene-3β,20α-diamine)、n,n,n’,n’-四甲基-1,4-丁二胺(n,n,n’,n’-tetramethyl-1,4-butanediamine)、4,4’-四甲基二胺基二苯甲烷(4,4’-tetramethyldiaminodiphenylmethane)、n,n,n’,n’-四甲基-1,4-对苯二胺(n,n,n’,n’-tetramethyl-1,4-benzenediamine)或n,n,n’,n’-四甲基-1,4-萘二胺(n,n,n’,n’-tetramethyl-1,4-napthalenediamine)。

附图说明

图1为光学显微镜放大图，显示所植入的人类肝癌细胞(hepg2细胞)于本发明的加了醇类的纤维素海绵体上的形态。

图2为光学显微镜放大图，显示所植入的人类肝癌细胞(hepg2细胞)于本发明但未加醇类的纤维素海绵体上的形态。

图3(a)为类器官培养于基底膜基质上于p1代或p2代的形态。

图3(b)为类器官培养于纤维素海绵体上于p1代或p2代的形态。

图4为类器官分别培养于基底膜基质或纤维素海绵体上于第3天、第7天及第11天的形态。

图5(a)为类器官于纤维素海绵体的分布情形(distribution)。

图5(b)为类器官于纤维素海绵体的数目(number)。

图6为类器官于投药前与投药后的存活率。

图7(a)为病患经化疗前的计算机断层扫描图。

图7(b)为病患经化疗后的计算机断层扫描图。

具体实施方式

以下的实施例非为限定用途，仅用以呈现此发明的多种面向与特性。

制备纤维素海绵体(cellulosesponge)

制备纤维素海绵体可以下述两步骤进行：

1.合成一含有一取代基的羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)：(1)将羟丙基纤维素(分子量≈10,000)加入甲苯(toluene)中以共沸蒸馏(azeotropicdistillation)的方式脱水；(2)将3.0克经脱水的羟丙基纤维素溶解于120毫升的二甲基甲酰胺(dimethylformamide，dmf)中；(3)将3.84毫升的异氰酸烯丙酯(allylisocyanate)溶解于5毫升的dmf中，再将此溶液缓慢逐滴地加入上述(2)的羟丙基纤维素溶液中；(4)加入37.5毫升的醇类(例如丙醇(propanol))以产生反应，该醇类的体积为dmf溶液总体积的30％(125毫升的dmf×30％＝37.5毫升，dmf：醇类的体积比为3.3：1)；(5)加入一滴的二月桂酸二丁基锡(dibutyltindilaurate)作为催化剂；(6)在室温下以磁石搅拌48小时；(7)将(6)的溶液以旋转蒸馏器(rotatoryevaporator)蒸馏以减少体积，再将当中的聚合物(polymer)以醚类(ether)分离出来；(8)将该反应产物以真空过滤(vacuumfiltration)的方式收集，并于乙醚(diethylether)中沉淀，残余的不纯物则以索氏萃取(soxhletextraction)方式从乙醚中移除，最后形成含有取代基的羟丙基纤维素。

2.伽马射线(γ-ray)照射：(1)将干燥形式的含有一取代基的一羟丙基纤维素配制为10重量％的水溶液并置于玻璃管中(直径10毫米×高度50毫米)；(2)温度测试步骤：以温度控制器调控温度，并使样品于每个温度下停留一段时间，温度增加时可观察到颜色的变化，水溶液会从透明变为乳白色；当观察到溶液变为白色乳液状，但还未形成分层与沉淀时(意指形成了一稳定的胶态系统，该胶态系统有利于接下来的三维多孔性结构的形成)，纪录对应的温度，得到的温度值落在38-45℃的范围中；该纪录所得的温度亦用于接下来以伽马射线照射产生的交联反应中；(3)在上述该纪录所得的温度下以伽马射线照射，以及(4)该含有取代基的羟丙基纤维素经伽马射线照射后产生固化(solidified)，再经过清洗与冷冻干燥，得到最后完成物。

制备纤维素海绵体的另一个方式可以下述两步骤进行：

1.合成含有一取代基的一羟丙基纤维素：(1)将羟丙基纤维素(分子量≈10,000)加入甲苯(toluene)中以共沸蒸馏(azeotropicdistillation)的方式脱水；(2)将3.6克经脱水的羟丙基纤维素溶解于200毫升的二甲基甲酰胺(dimethylformamide，dmf)中；(3)将4.18毫升的异氰酸烯丙酯(allylisocyanate)溶解于5毫升的dmf中，再将此溶液缓慢逐滴地加入上述(2)的羟丙基纤维素溶液中；(4)加入24.6毫升的醇类(例如丙醇(propanol))以产生反应，该醇类的体积为dmf溶液总体积的12％(205毫升之dmf×12％＝24.6毫升，dmf：醇类的体积比为8.3：1)；(5)加入一滴的二月桂酸二丁基锡(dibutyltindilaurate)作为催化剂；(6)在室温下以磁石搅拌48小时；(7)将(6)的溶液以旋转蒸馏器(rotatoryevaporator)蒸馏以减少体积，再将当中的聚合物(polymer)以醚类(ether)分离出来；(8)将该反应产物以真空过滤(vacuumfiltration)的方式收集，并于乙醚(diethylether)中沉淀，残余的不纯物则以索氏萃取(soxhletextraction)方式从乙醚中移除，最后形成含有取代基之羟丙基纤维素。

2.固化步骤：(1)将干燥形式的含有一取代基的一羟丙基纤维素配制为10重量％的水溶液并置于玻璃管中(直径10毫米×高度50毫米)；(2)在2-8℃温度条件下加入1.2克的过硫酸铵(ammoniumpersulfate，aps)与35微升的n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(n,n,n’,n’-tetramethylethylenediamine,temed)于上述(1)溶液中；(3)将(1)的该玻璃管置于低温(-20℃)下反应24小时；(4)将(3)的该玻璃管移置室温下继续反应48小时，再经过清洗与冷冻干燥，得到最后完成物。

本发明但未加醇类的制备纤维素海绵体的方法如同上述，只除了省略步骤1中(4)的加入醇类的步骤。

纤维素海绵体的应用

细胞培养条件：人类肝癌细胞(hepg2细胞)，使用的培养基为辅有10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的高糖型杜氏改良依格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem)，细胞培养箱的条件为37℃与5％二氧化碳。

植入细胞的步骤：将纤维素海绵体置于48孔盘(48-wellplate)中，hepg2细胞液之浓度调整为每毫升5×10⁶个细胞，取60微升之该浓度的hepg2细胞液植入纤维素海绵体中，于细胞培养箱培养4小时后，将该置有纤维素海绵体的细胞培养盘取出，并加入500微升的培养基，之后每隔三天以磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline)清洗该纤维素海绵体并替换新鲜的培养基。

图1与图2为观察hepg2细胞于植入纤维素海绵体24小时后的情形：图1为所植入的细胞于本发明的加了醇类的纤维素海绵体中的形态，图2为所植入的细胞于本发明但未加醇类的纤维素海绵体中的形态；两图皆为植入hepg2细胞后的第二天以光学显微镜观察得到的放大图。结果发现：本发明的加了醇类的纤维素海绵体(图1)，其孔隙的形态结构未变，而植入的细胞其所呈现的球形形态亦接近人体肝脏细胞的真实形态；而本发明但未加醇类的纤维素海绵体(图2)则显示植入细胞后，纤维素海绵体的孔隙形态结构并未维持，其孔径明显缩减，而细胞形态则表现出细胞凋亡的倾向；该结果也显示孔隙的形态结构会明显影响细胞的正常形态。

评估临床上与生体外(invitro)反应

患者为一名60岁女性，临床诊断为直肠癌，tnm分期(t，tumor，指肿瘤本身的情况；n，lymphnodes，指肿瘤转移到淋巴结的情况；m，metastasis，指肿瘤有无远处转移)判定为t4n0n0，病理学诊断为腺癌ii级。以患者肿瘤组织培养于支架(基底膜基质(matrigel)或纤维素海绵体(cellulosesponge))以获得患者来源的类器官(patient-derivedorganoid,pdo)，培养方式如下：

1.将肿瘤组织裂解为细胞以获得肿瘤多种细胞团簇(tumormulticellularcluster)的步骤：(1)取一黄豆粒大小的患者肿瘤组织，以磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，pbs)清洗；(2)放入24孔盘中，加入肿瘤裂解液；(3)用无菌的剪刀剪碎组织；(4)补加裂解液，37℃，作用2小时；(5)将裂解液经100微米的尼龙过滤膜(nylonfilter)过滤；(6)离心每分钟1500转(revolutionsperminute,rpm)，5分钟，弃上清液；(7)加入约3毫升的红血球裂解液，重新悬浮细胞，室温5分钟；(8)加入约10毫升的pbs以稀释含有红血球裂解液的细胞悬浮液；(9)离心1500rpm，5分钟，弃上清液；(10)加入约8毫升的pbs清洗细胞，离心1500rpm，5分钟，弃上清液；(11)加入1毫升的pbs，重新悬浮细胞沉淀；(12)取得肿瘤多种细胞团簇。

2.细胞培养步骤：(1)配置培养液：高级杜氏改良依格尔培养基/f12辅以双特异性抗体、每公升10毫摩尔的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid，hepes)、一含有稳定形态的l-麸酰胺酸和l-丙胺酰-l麸酰胺酸的补充物(glutamax)与10％的胎牛血清；(2)用镊子将支架(基底膜基质或纤维素海绵体)放置入48孔盘中；(3)加入20微升的肿瘤单细胞悬浮液；(4)37℃放置4小时；(5)加入300微升的培养液，放入细胞培养箱(37℃与5％二氧化碳)中继续培养；(6)每三天移除培养液，以pbs润洗，再加入新的培养液。(7)于第三天、第七天、第十一天，以光学显微镜做观察。

本发明建立了来自病患癌症组织(包含癌细胞及与之相对应的癌旁组织)所形成的类器官，已经从p1代传到p2代(图3(a)及图3(b))，并冻存保留。患者来源的类器官(patient-derivedorganoid,pdo)的生长过程如图4所示，以光学显微镜观察细胞生长情况，观察到纤维素海绵体中肿瘤单细胞随着时间，形成的类器官尺寸有增长。因此，可知纤维素海绵体环境有助于细胞生长以及类器官形成。特别需要说明的是，这些类器官是分别在基底膜基质和纤维素海绵体中进行培养获得的。纤维素海绵体采用的是植物来源的羟丙基纤维素，对类器官的生长具有如下优点：(1)相对于在基底膜基质中进行培养获得的pdo(pdo^matrigel)，在纤维素海绵体中进行培养获得的pdo(pdo^cellusponge)的大小生长较均匀(图3(a)：pdo^matrigel；图3(b)：pdo^cellusponge)；(2)相对于pdo^matrigel，pdo^cellusponge的数量较多，这主要归结于基底膜基质和纤维素海绵体的空间结构的不同，基底膜基质呈小丘状，类器官主要生长在丘陵中心的基底膜基质较多的部位，而纤维素海绵体呈圆柱体，类器官可以在材料中均匀生长，生长空间较大，因此数量较多(图5)；(3)培养方法经济和简便：传统的pdo^matrigel的培养液除了：一种称为r-spondin-1的分泌型蛋白质、上皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、一种称为noggin的与组织生长有关的蛋白质、及一种称为wnt3a的与发育有关的蛋白质以外，另外还需要加入烟碱酰胺(nicotinamide)、退行发育淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，alk)的小分子抑制剂和p38蛋白质的抑制剂(jung,p.etal.isolationandinvitroexpansionofhumancolonicstemcells.nat.med.17,1225-1227(2011))。本发明证实纤维素海绵体中的pdo^cellusponge的培养无需加入这三种小分子抑制剂，就可以达到pdo^cellusponge的长期培养。此外，pdo^cellusponge的培养可以避免基底膜基质培养的繁琐操作。

利用活细胞计量套组-8测定(cellcountingkit-8assay,cck-8assay)作为pdo存活率测试

1.用镊子将纤维素海绵体放置入48孔盘中；2.加入20微升的肿瘤单细胞悬浮液；3.37℃放置4小时；4.加入300微升的培养液，放入细胞培养箱(37℃与5％二氧化碳)中继续培养；5.于第一天、第二天、第三天、第四天，分别执行cck-8细胞存活率试验；其中以顺铂(cisplatin，cp)加5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-fu)为投效药物组合，对照组则为没有投药的控制组；6.于实验时间点移除孔盘中的培养液；7.在每个孔盘中加入200微升的新鲜培养液与20微升的cck-8溶液；8.于37℃环境下培养1-4小时；9.量测吸收光450nm的读值。

由图6可发现类器官在投予药物顺铂与5-氟尿嘧啶后，存活率明显下降。因此认为类器官在投予药物前后是具有指标性。接着依据cck-8测定的结果给予患者投药，执行化疗。化疗的治疗方案为奥沙利铂(oxaliplatin)联合卡培他滨(capecitabine)方案(xelox方案)，疗程方式为：第一天注射奥沙利铂，连续两周口服卡培他滨，停药一周。三周为一个疗程，两个疗程后评定疗效。由图7可发现患者肿瘤位置(箭头指示位置)的灰白亮区明显变少，判定为肿瘤组织部分缓解(partialresponse，pr)，而此结果与类器官体外培养的数据相符合。因此认定纤维素海绵体不仅适合初代肿瘤细胞生长，更可利用此平台做临床药测模拟。使医生可依据患者的模拟结果，给予服药种类判定，以实现个体化医疗。