检测B族链球菌的引物组、包含所述引物组的引物液和试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及病原体的检测和诊断技术领域，尤其涉及用于检测b族链球菌的引物组、包含所述引物组的引物液和试剂盒及其应用。

背景技术：

b族链球菌(groupbstreptococcus，gbs)，学名为无乳链球菌(streptococcusagalactiae)，该菌正常寄居于阴道和直肠，它是一种革兰阳性球菌，属兼性厌氧菌，一种条件致病菌，一般正常健康人群感染gbs并不致病。据统计约10％～30％的孕妇有感染gbs，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带了这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，其中有5％会导致死亡。孕妇感染表现为菌血症、泌尿系统感染、胎膜感染、子宫内膜感染以及创伤感染。基于gbs感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查gbs显得尤为重要。

长期以来，gbs感染的常规检测方法是细胞培养法，一直被视为确诊gbs感染的金标准，但该方法存在对样本采集和培养条件要求高、耗时、易污染等不足之处。另外，gbs感染还可以通过免疫试验法和实时荧光定量pcr法进行检测。其中，免疫试验法通过血清抗原/抗体检测，该方法虽简便、快速，但无法提供现症感染资料，且特异性和灵敏度不够。实时荧光定量pcr是近几年兴起来的一种融汇了pcr高敏感性、探针杂交高特异性和光谱检测高精确性等技术优点的检测技术，具有快速、高特异、高敏感、可定量等优点，可作为临床检测实用方法。但目前国内此类试剂提取核酸费时、费力，在操作过程中容易导致污染，而且大部分试剂没有预防假阴性的内标控制和防污染体系，因此影响检测结果的重复性和稳定性。

随着检验医学的发展，一些分子生物学技术，如pcr、链置换扩增等，在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。然而，由于分子生物学技术检测核酸对仪器、设备的要求较高，操作程序复杂，限制了其作为快速诊断方法的开展与推广。

环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，lamp)技术除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀(从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色)或者荧光即可，解决了核酸诊断中设备昂贵、程序复杂等难题。lamp反应仅需一种具有链置换活性的dna聚合酶(如bstdna聚合酶)及针对靶基因6-8个区域设计的4-6条引物(其中f3/b3和fip/bip为必需引物，lf/lb为可选引物)便可在60℃～66℃的恒定温度下实现几十分钟内大于10⁹倍的靶基因扩增，凭借极高的扩增效率及较低的仪器要求，该技术已逐渐应用于病原体识别、生物标志物检测、性别鉴定等。

然而，近年来lamp技术在实验室中的实际应用相对局限，进展相对缓慢，其原因在于：(1)当前的lamp体系难以实现真正意义上的高通量检测，有待于进一步完善；(2)虽然lamp体系在检测过程中无需升降温，可以大大加快反应速度，实现快速、高效检测，然而lamp体系的稳定性较差，且lamp扩增中由于引物数目众多，加剧了引物来源的非特异扩增问题，包括引物内部的非特异性扩增(空白对照体系中出现假阳性)和引物与模板的非特异性结合扩增，所述非特异性扩增的问题严重限制了该技术的实际应用。

bstdna聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和双链特异的5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性，该酶介导的等温扩增具有快速、灵敏、特异性强等优点。另外，微流控芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标同时检测，极大的提高了检测效率。但是，目前尚未有基于bstdna聚合酶介导的等温扩增检测b族链球菌的多功能微流控芯片。

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种用于检测b族链球菌的引物组、包含所述引物组的引物液和试剂盒及其应用，将基于bstdna聚合酶介导的等温扩增的多功能微流控芯片技术应用于b族链球菌的核酸检测，且在多功能微流控芯片中完成b族链球菌的核酸提取，利用多功能微流控芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高b族链球菌的检测速度、通量和灵敏度，大大降低b族链球菌的检测成本，缩短检测时间。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入地研究、反复实验，发现通过利用特定序列的引物组和多功能微流控芯片能够特异性、高通量的检测b族链球菌，并且具有较高的检测灵敏度，从而完成了本发明。即，本发明如下所述：

本发明首先提供了一种检测b族链球菌的引物组。

本发明所提供的检测b族链球菌的引物组，包括上游外引物f3和下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip以及下游环引物lb，其核苷酸序列分别如下所示：

上游外引物f3：ggtgcattgttattttcacca(seqidno:1)

下游外引物b3：tcaacactagtaatagcctca(seqidno:2)

上游内引物fip：

gccatttgctgggcttgattattacagtacatgctgatcaagtgac(seqidno:3)

下游内引物bip：

agcttgatcaagatagcattcagtttaaccggtttttcataatctgttc(seqidno:4)

下游环引物lb:tatcaaagataatgttcagg(seqidno:5)

本发明所述的检测b族链球菌的引物组还进一步包括：用于扩增内标片段的对照引物组，其包括内标外引物f3和内标外引物b3、内标内引物fip和内标内引物bip，所述引物的核苷酸序列分别如下所示：

内标外引物f3：ccttggacccagaggttctt(seqidno:6)

内标外引物b3：acgtgcagcttgtcacag(seqidno:7)

内标内引物fip：

agccttcaccttagggttgcctgagtcctttggggatctgt(seqidno:8)

内标内引物bip：

aagtgctcggtgcctttagtgacagctcactcagtgtggc(seqidno:9)

本发明还提供一种引物液，其含有上文所述的引物组。所述引物的工作浓度分别为：6～8μm名称中带“f3”的引物；6～8μm名称中带“b3”的引物；55～57μm名称中带“fip”的引物；55～57μm名称中带“bip”的引物；27～29μm名称中带“lb”的引物。优选的，所述名称中带“f3”的引物的工作浓度为7μm，所述名称中带“b3”的引物的工作浓度为7μm，所述名称中带“fip”的引物的工作浓度为56μm，所述名称中带“bip”的引物的工作浓度为56μm，所述名称中带“lb”的引物的工作浓度为28μm。

本发明进一步提供一种检测b族链球菌的链置换型dna聚合酶介导的等温扩增试剂，所述试剂包括(1)含有上文所述检测b族链球菌的引物组的预混液，(2)含有上文所述用于扩增内标片段的对照引物组的预混液和(3)核酸提取试剂；其中(1)或(2)所述的预混液中还包括链置换型dna聚合酶、datp、dctp、dgtp、dttp和荧光染料；所述链置换型dna聚合酶具体可为bstdna聚合酶；所述荧光染料具体可为sybrgreen、cyto9、lcgreen、evagreen中的任意一种；所述预混液中还可包括防污染体系，优选的，所述防污染体系包含在所述预混液中添加的udg酶以及dutp。其中所述的“核酸提取试剂”包含5％树脂材料、10×等温扩增(isothermalamplification)反应缓冲液和mgso4。优选的，所述树脂材料为商品化的树脂，具体为一种微纳米介孔吸附树脂，所述树脂的直径为100μm-500μm，其表面介孔尺寸为10nm-100nm，且表面含有大量亚氨基二乙酸盐离子，可以聚集吸附大量非核酸性有机物；所述10×等温扩增反应缓冲液为包含250mmtris、300mmkcl和5％bsa溶液的缓冲母液。

本发明还提供一种用于检测b族链球菌的试剂盒，所述试剂盒包含上文所述的等温扩增试剂和多功能微流控芯片。其中所述的多功能微流控芯片为圆盘形多功能微流控芯片，其设有互不连通的8个样本加样孔(参见附图1中的1-8)，可以同时检测8个待测样本，每个样本加样孔对应4个反应池，通过离心将加样孔中的核酸分散到各个反应池，进行扩增。且反应池中固定有检测所述b族链球菌和内标片段的链置换型dna聚合酶介导的等温扩增试剂；b族链球菌的核酸提取在多功能微流控芯片的样本加样孔中完成。在具体的实施中，所述4个反应池可以包含1个阳性对照(内标)反应池、2个阴性对照反应池和1个待测样本扩增反应池。

本发明还提供一种非治疗和诊断目的的检测b族链球菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1)引物组的包埋：将上文所述的预混液加入到多功能微流控芯片相应的反应池中，真空干燥：

步骤2)待测样本核酸的提取：将待测样本与上文所述的核酸提取试剂混合后加入到多功能微流控芯片的样本加样孔中；

步骤3)环介导等温扩增反应：待测样本的核酸在离心力的作用下进入相应的反应池中，进行环介导等温扩增反应；

步骤4)结果判断：根据是否出现“s”型扩增曲线判断待测样本中是否包含b族链球菌。

优选的，所述步骤3)环介导等温扩增反应的条件为50℃、5min，64℃扩增45～90min；更优选的，所述扩增的时间为60min。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明将b族链球菌的特异核酸序列的检测与多功能微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的b族链球菌核酸提取以及检测的微流控芯片及其检测方法。与pcr技术或其他技术相比，本发明具有特异性强、响应速度快、灵敏度高、结果判定简单、操作简便等优点。具体来说，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)特异性强：本发明提供的b族链球菌的引物组与其他病原微生物无交叉反应，如沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、白念珠菌、人型支原体、生殖支原体、阴道毛滴虫，可以从相差一个核苷酸的基因样品中找出相应的靶序列进行等温扩增。

2)响应速度快：能够在60min内完成高效率的基因扩增。

3)灵敏度高：环介导等温扩增的灵敏度是普通pcr扩增的10～100倍，该引物组的最低检测限为10拷贝/μl。

4)结果判定简单：可根据荧光检测仪上的荧光曲线判定结果，不需要经过凝胶电泳检测。

5)操作简便：只需将待测样本与核酸提取试剂混合后加入多功能微流控芯片的样本加样孔中，待测样品的核酸在离心力的作用下进入预先包被了引物组的反应池中，可在多功能微流控芯片中完成样本核酸的提取以及环介导等温扩增反应。本发明中使用的核酸提取试剂是一种化学整合树脂，可以整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质，提取过程在多功能微流控芯片中5min即可完成，进而通过bstdna聚合酶介导的等温基因扩增技术在多功能微流控芯片中实现b族链球菌的核酸扩增。本发明提供的检测b族链球菌的试剂盒，可快速、准确地检测b族链球菌，以弥补针对b族链球菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明的检测试剂盒还加入了防污染体系，能有效的防止扩增产物的污染。对于临床而言，能够在1h内获得检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量pcr方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1为多功能微流控芯片示意图。图1中所示的1-8分别为样本加样孔；所示的a1、a5、b1、b5、c1、c5、d1、d5在具体的实施例中可以作为阳性对照(内标)反应池；所示的a2-a3、a6-a7、b2-b3、b6-b7、c2-c3、c6-c7、d2-d3、d6-d7在具体的实施例中可以作为阴性对照反应池；所示的a4、a8、b4、b8、c4、c8、d4、d8在具体的实施例中可以作为待测样本扩增反应池。

图2-1至图2-6为利用多功能微流控芯片和荧光定量pcr的方法检测3个b族链球菌分泌物拭子样本的检测结果图。图2-1、图2-2和图2-3分别为待测样本1、2、3的扩增结果。图2-1自左向右分别为a1、a2-a3、a4反应池的扩增结果；图2-2自左向右分别为a5、a6-a7、a8反应池的扩增结果：图2-3自左向右分别为b1、b2-b3、b4反应池的扩增结果。其中固定有内标的引物组的反应池a1、a5、b1均呈现“s”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有检测b族链球菌的引物组的反应池a4、a8和b4均呈现“s”型扩增曲线，说明待测样本1，2和3中均含有b族链球菌病原体。图2-4、图2-5和图2-6分别为待测样本1、2、3的荧光定量pcr扩增曲线图。

图3-1至图3-8为检测b族链球菌多功能微流控芯片的特异性扩增曲线图。图3-1至图3-8分别为沙眼衣原体样本扩增曲线图、淋球菌样本扩增曲线图、解脲脲原体样本扩增曲线图、白念珠菌样本扩增曲线图、人型支原体样本扩增曲线图、生殖支原体样本扩增曲线图、阴道毛滴虫样本扩增曲线图和b族链球菌样本扩增曲线图。

图4-1至图4-8为检测b族链球菌多功能微流控芯片灵敏度的扩增曲线图。其中图4-1和图4-2均为阴性对照扩增曲线图，图4-3至图4-8分别为10¹copies/ul、10²copies/ul、10³copies/ul、10⁴copies/ul、10⁵copies/ul、10⁶copies/ul质粒扩增曲线图。

上述图2-1、图2-2、图2-3和图3-1至图3-8以及图4-1至图4-8中的横坐标均为时间(min)，纵坐标均为荧光强度。图2-4、图2-5、图2-6中的横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

实施例1环介导等温扩增引物组的设计和合成

1.1序列获得：

通过对genebank中b族链球菌camp因子(campfactor，cfb)序列查询，用vectornti软件对各种来源的cfb基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并具有很好的同源性。

1.2引物设计

(1)将b族链球菌的cfb基因的保守区段(核苷酸序列如seqidno:10所示)和内标hbb(hemoglobinbeta-chain，血红蛋白-β链)基因的保守区段(核苷酸序列如seqidno:11所示)分别导入http://primerexplorer.jp/e/v3_manual/index.html软件中，选取f1c和b1c的tm值相近、f3/b3/f2/b2的tm值相近，且f1c和b1c的tm值比f3/b3/f2/b2的tm值大5℃，5’dg和3’dg的绝对值小于4的dna序列作为候选引物。

(2)引物合成：将下表1中的引物序列委托英潍捷基公司合成，备用。

(3)引物确认：将合成好的引物用te或ddh20进行溶解，得到用于制备本发明多功能微流控芯片所需要的特异、灵敏的引物，将合成的引物(检测b族链球菌的引物组或对照引物组)连同bstdna聚合酶、datp、dctp、dgtp、dttp和荧光染料一起制备成预混液，加入到多功能微流控芯片相应的反应池中，真空干燥，备用。

在本发明的优选实施例中，9条引物如表1所示。其中，编号no：1-5(seqidno:1-seqidno:5)的引物序列选自b族链球菌camp因子基因的dna序列，用于特异性扩增b族链球菌；编号no：6-9(seqidno:6-seqidno:9)的引物序列选自hbb基因的dna序列，作为扩增内标片段用。

表1：本发明多功能微流控芯片上选用的引物序列

实施例2：用于检测b族链球菌的试剂盒的制备

下列实施例中的b族链球菌、沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、白念珠菌、人型支原体、生殖支原体、阴道毛滴虫待测样本均来源于上海市东方医院，具体可以来源于妊娠34-37周孕妇的生殖道和直肠分泌物样本。

本发明所提供的用于检测b族链球菌的试剂盒组成如下：

2.1预混液

预混液包含(1)12mmdntps、(2)0.5μm荧光染料、(3)1u/μlbstdna聚合酶、(4)0.2u/μludg酶和6mmdutp、(5)核苷酸序列如seqidno：1-5所示的检测b族链球菌的引物组或核苷酸序列如seqidno：6-9所示的用于扩增内标片段的对照引物组。

2.2核酸提取试剂

核酸提取试剂包含5％树脂材料、10×等温扩增反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液。其中所述的树脂材料为商品化的树脂，具体为一种微纳米介孔吸附树脂，所述树脂的直径为100μm-500μm，其表面介孔尺寸为10nm-100nm，且表面含有大量亚氨基二乙酸盐离子，可以聚集吸附大量非核酸性有机物，其中所述的10×等温扩增反应缓冲液为包含250mmtris、300mmkcl和5％bsa溶液的缓冲母液。

2.3装载有引物组的32反应池多功能微流控芯片

所述32反应池多功能微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产，其型号为8×4，示意图如图1所示。

所述8×4反应池多功能微流控芯片中的反应池可用于包埋实施例1在表1中所示的引物序列。其中，所述seqidno：1-5用于扩增b族链球菌，由序列表中序列1-5所示的五条单链dna分子组成，包埋于待测样本扩增反应池a4、a8、b4、b8、c4、c8、d4、d8中；seqidno：6-9用于扩增人基因组中管家基因hbb的序列，由序列表中序列6-9所示的四条单链dna分子组成，包埋于阳性对照(内标)反应池a1、a5、b1、b5、c1、c5、d1、d5中；所述阴性对照的反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3、b6、b7、c2、c3、c6、c7、d2、d3、d6、d7，不包埋任何引物。其中，将引物包埋入多功能微流控芯片的方法为：将上述引物(阴性对照反应池中不添加任何引物)、荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶和dutp混合，配制成预混液；取2μl所述预混液点入相应的多功能微流控芯片的反应池中，抽真空干燥2小时后，将多功能微流控芯片的背面封膜备用。所述32反应池多功能微流控芯片可以同时检测8个待测样本。

实施例3：利用多功能微流控芯片检测b族链球菌分泌物拭子样本

3.1采用实施例2中2.3所述的方法，将实施例1中用于特异性检测b族链球菌的引物组与荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp混合，配制成混合溶液，分别固定在待测样本扩增反应池a4、a8、b4；将实施例1中用于监控整个反应的对照引物组与荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp混合，配制成混合溶液，分别固定在阳性对照(内标)反应池a1、a5、b1；将荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp配制成混合溶液，分别固定在阴性对照反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3，作为阴性对照，将该多功能微流控芯片抽真空干燥2小时后，背面封膜备用。

3.2对3例来自上海市东方医院的待测分泌物样本通过该芯片进行检测：将50μl待测样本1与50μl实施例2的2.2中所述的核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片加样孔1；将50μl待测样本2与50μl上文所述的核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片加样孔2；将50μl待测样本3与50μl上文所述的核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片加样孔3，用膜封住3个加样孔后，放入多功能微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪(仪器型号：sc-ma3000，可购自上海速创诊断产品有限公司)中95℃加热5min后，启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，所述扩增条件为50℃、5min，64℃扩增60min。

结果见图2-1至图2-3，固定有内标的引物组的阳性对照(内标)反应池a1、a5、b1均呈现“s”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的阴性对照反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有特异性扩增b族链球菌的引物组的待测样本扩增反应池a4、a8和b4均呈现“s”型扩增曲线，说明待测分泌物样本1、2和3中均含有b族链球菌病原体。

为了证明本发明的引物组试验结果的客观真实性，同时对上述待测样本1、2和3使用商品化的试剂盒进行荧光定量pcr检测，所述商品化的试剂盒采用泰普生物科学(中国)有限公司的具有医疗器械注册证的产品：国械注准20153400272b族链球菌核酸检测试剂盒(荧光pcr法)进行核酸检测，检测结果参见图2-4、图2-5和图2-6。

实施例四：检测b族链球菌多功能微流控芯片的特异性

利用实施例2中2.3制备的多功能微流控芯片进行特异性实验

4.1将实施例1中用于检测特异性扩增b族链球菌的引物组与荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp混合，配制成混合溶液，分别固定在待测样本扩增反应池a4、a8、b4、b8、c4、c8、d4、d8；将实施例1中用于监控整个反应的对照引物组与荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp混合，配制成混合溶液，分别固定在阳性对照(内标)反应池a1、a5、b1、b5、c1、c5、d1、d5；将荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp配制成混合溶液，分别固定在阴性对照反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3、b6、b7、c2、c3、c6、c7、d2、d3、d6、d7。将该多功能微流控芯片抽真空干燥2小时后，背面封膜备用。

4.2将50μl沙眼衣原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔1；将50μl淋球菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔2；将50μl解脲脲原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔3；将50μl白念珠菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔4；将50μl人型支原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔5；将50μl生殖支原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔6；将50μl阴道毛滴虫样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔7；将50μlb族链球菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入多功能微流控芯片样本加样孔8。用膜封住8个加样孔后，放入多功能微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪中95℃加热5min后，启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，50℃、5min，64℃扩增60min。

结果见图3-1至图3-8，固定有对照引物组的阳性对照(内标)反应池a1、a5、b1、b5、c1、c5、d1、d5均呈现“s”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的阴性对照反应池a2、a3、a6、a7、b2、b3、b6、b7、c2、c3、c6、c7、d2、d3、d6、d7均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有b族链球菌的引物组的待测样本扩增反应池a4、a8、b4、b8、c4、c8、d4呈现直线扩增曲线，说明本发明请求保护的用于检测b族链球菌的引物组对沙眼衣原体样本、淋球菌样本、解脲脲原体样本、白念珠菌样本、人型支原体样本、生殖支原体样本、阴道毛滴虫样本无交叉反应；待测样本扩增反应池d8呈现“s”型扩增曲线，说明可以扩增b族链球菌样本。

实施例五：检测b族链球菌多功能微流控芯片的灵敏度

利用实施例2中2.3制备的多功能微流控芯片进行灵敏度实验，检测中使用的质粒样本委托上海生工进行合成，所述质粒样本中包含了cfb基因的保守区段。

5.1将实施例1中用于检测b族链球菌的引物组与荧光染料、dntps、bstdna聚合酶、udg酶、dutp混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池a1-a3、a5-a7；b1-b3、b5-b7；c1-c3、c5-c7；d1-d3、d5-d7。共计24个反应池中，并将该多功能微流控芯片抽真空干燥2小时，背面封膜备用。

5.2将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、ddh2o配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔1和样本加样孔2；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10¹copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔3；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10²copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔4；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10³copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔5；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10⁴copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔6；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10⁵copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔7；将10×isothermalamplification反应缓冲液、150mmmg²⁺水溶液、10⁶copies/μl的质粒配制的混合液加入多功能微流控芯片的样本加样孔8。用膜封住8个加样孔后，放入多功能微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪中启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，50℃、5min，64℃扩增60min；

结果见图4-1至图4-8，样本加样孔1和2对应的反应池a1-a3、a5-a7均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；样本加样孔3对应的反应池b1-b3、样本加样孔4对应的反应池b5-b7、样本加样孔5对应的反应池c1-c3、样本加样孔6对应的反应池c5-c7、样本加样孔7对应的反应池d1-d3、样本加样孔8对应的反应池d5-d7均呈现“s”型扩增曲线，说明b族链球菌引物组的最低检测限为10¹copies/μl。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海速创诊断产品有限公司

上海速芯生物科技有限公司

<120>检测b族链球菌的引物组、包含所述引物组的引物液和试剂盒及其应用

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