一种非编码RNA分子lnc-DC在预测乳腺癌预后中的应用的制作方法

文档序号:15457565发布日期:2018-09-15 01:33

本发明属于肿瘤生物治疗领域,涉及一种非编码RNA分子lnc-DC在预测乳腺癌预后中的应用。



背景技术:

乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤。乳腺作为人体重要的激素靶向器官,在乳腺发生的恶性肿瘤中70%的乳腺癌表达雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)或者孕激素受体(Progesterone Receptor,PR),而该类型乳腺癌对激素抑制治疗较为敏感,具有内分泌治疗指征。

他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是一种非固醇类抗雌激素药物,是目前绝经前女性乳腺癌内分泌治疗的一线用药,具有十分重要的地位。尽管临床观察到他莫昔芬在大部分乳腺癌患者中具有确切的疗效和较小副作用,但对他莫昔芬的耐药问题始终未解。有约30%的乳腺癌患者对他莫昔芬存在原发性耐药,也有部分患者在初始治疗时有效但继而出现获得性耐药,但目前尚无有效的生物标志物可用于预测他莫昔芬敏感性或用于靶向治疗逆转耐药。

对于绝经前激素受体阳性乳腺癌患者,在进行内分泌药物治疗之前,筛选出乳腺癌预后良好的患者是当前迫切需要解决的问题。因而,如果通过有效的分子标志物筛选乳腺癌预后良好的患者,就可以精准地指导乳腺癌患者的内分泌治疗,将大大提高治疗的有效率,降低乳腺癌患者的死亡风险。



技术实现要素:

本发明目的在于提供一种非编码RNA分子lnc-DC在预测乳腺癌预后中的应用。

在第一方面,本发明提供了一种筛选乳腺癌患者预后相关标志物的方法,所述方法包括测定乳腺癌患者中非编码Lnc-RNA分子Lnc-DC的表达情况,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方案中,所述乳腺癌患者经他莫昔芬治疗。

在一个实施方案中,所述方法包括使用引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

在一个实施方案中,所述方法包括使用选自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9的探针。

在第二方面,本发明提供了一种非编码Lnc-RNA分子Lnc-DC在制备预测乳腺癌患者预后的检测剂中的应用,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方案中,所述乳腺癌患者经他莫昔芬治疗。

在一个实施方案中,所述检测剂包括引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

在一个实施方案中,所述检测剂包括选自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9的探针。

在第三方面,本发明提供了一种用于检测Lnc-RNA分子Lnc-DC表达情况的引物或探针。

在一个实施方案中,所述引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

在一个实施方案中,所述探针选自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9。

在第四方面,本发明提供了一种用于检测Lnc-RNA分子Lnc-DC表达情况的试剂盒,所述试剂盒包括本发明第三方面的引物或探针。

在第五方面,本发明还提供了一种提高乳腺癌患者预后的方法,所述方法包括给予所述乳腺癌患者Lnc-RNA分子Lnc-DC抑制剂,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方案中,所述分子Lnc-DC抑制剂为Lnc-RNA分子Lnc-DC的Dual gRNA序列。

在一个实施方案中,所述Dual gRNA序列选自SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。

在第六方面,本发明还提供了Lnc-RNA分子Lnc-DC抑制剂用于制备提高乳腺癌患者预后药剂的应用,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方案中,所述乳腺癌患者经他莫昔芬治疗。

在一个实施方案中,所述分子Lnc-DC抑制剂为Lnc-RNA分子Lnc-DC的Dual gRNA序列。

在一个实施方案中,所述Dual gRNA序列选自SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。

在第七方面,本发明提供了一种非编码Lnc-RNA分子Lnc-DC在制备区分乳腺癌患者检测剂中的应用,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述Lnc-DC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方案中,所述乳腺癌患者经他莫昔芬治疗。

在一个实施方案中,所述检测剂包括引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

在一个实施方案中,所述检测剂包括选自SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9的探针。

与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:本发明首次发现Lnc-RNA分子Lnc-DC作为逆转乳腺癌治疗的干预靶点,同时其可作为预测乳腺癌预后的有效标志物,填补了这一领域的空白,不仅具有科学意义的创新,更具有开发成检测试剂盒及相关靶向药物的巨大临床应用价值。

附图说明

通过以下附图对本发明进行说明。

图1为通过CRISPR/Cas9-SAM文库系统对MCF-7细胞进行转染,进而在激素非依赖性生长环境中筛选出非激素依赖性生长MCF-7细胞的过程。

图2激素剥夺环境中存活的MCF-7细胞进行gRNA的RT-PCR检测。在激素剥夺环境中绝大部分MCF-7细胞死亡,少量存活的MCF-7细胞进行gRNA的RT-PCR检测后发现,Lnc-DC表达升高最为明显。

图3他莫昔芬耐药的乳腺癌MCF-7细胞(称为MCF-7R细胞)检测Lnc-DC表达水平。图3显示不同类型细胞Lnc-DC表达水平,他莫昔芬耐药的乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7R)高表达Lnc-DC。BS:筛选前;AS:筛选后;ASR:筛选后他莫昔芬耐药细胞。

图4高表达Lnc-DC的MCF-7细胞(称为MCF-7lnc-DC+),通过Annexin-V-7-AAD检测MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬的耐药能力。相比于普通MCF-7细胞,MCF-7R细胞及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬凋亡诱导敏感性显著下降。

图5MCF-7细胞高表达Lnc-DC后(成为MCF-7lnc-DC+),通过TUNEL试验检测他莫昔芬对MCF-7lnc-DC+凋亡的影响。相比于普通MCF-7细胞,MCF-7R细胞及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬凋亡诱导敏感性显著下降。

图6为Lnc-DC不同表达水平的乳腺癌晚期患者复发-时间曲线(relapse-free survival)。较早复发的患者Lnc-DC表达水平明显高于较晚复发的患者。

具体实施方式

下面结合具体的实施案例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明人发现了Lnc-RNA在乳腺癌他莫昔芬耐药中的重要作用及相应的生物学功能、机制,可以用于预测乳腺癌患者的预后,为开发新的靶向药物提供选择。本发明人发现,所述Lnc-RNA分子Lnc-DC可以通过抑制他莫昔芬诱导的乳腺癌细胞凋亡进而促进其对他莫昔芬耐药,因此可以用于制备提高乳腺癌患者预后的药剂。

本发明人发现了一种可以引起乳腺癌他莫昔芬耐药的Lnc-RNA,为Lnc-DC,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明人发现所述Lnc-RNA分子Lnc-DC在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞中高表达。因此,上述Lnc-RNA分子Lnc-DC可以应用于预测乳腺癌他莫昔芬敏感性。为了筛选对他莫昔芬有效的患者,需要选取Lnc-RNA分子Lnc-DC低表达的那些乳腺癌患者,将乳腺癌患者区分为Lnc-RNA分子Lnc-DC高表达和Lnc-DC低表达组。为了检测Lnc-RNA分子Lnc-DC的表达情况,本发明还提供了检测Lnc-RNA分子Lnc-DC的引物或探针,以及包括所述引物或探针的试剂盒。

所述引物可以为Lnc-DC-RT-5.1ccttccaacagcaacatgaa(SEQ ID NO.2)和Lnc-DC-RT-3.1tgtccttaccctgcaacaca(SEQ ID NO.3),使用上述引物扩增Lnc-DC表达如图2、3所示。

所述探针可以是如下的任一个(5Biosg代表5’端生物素标记;"+"代表核苷酸锁住修饰):

/5Biosg/A+G+G+CCAGGGGTG+G+GACTAGGGACT+G+C+A(SEQ ID NO.4)

/5Biosg/T+T+G+CTGTTGGAA+G+GCTTTGGAAAA+A+C+A(SEQ ID NO.5)

/5Biosg/A+A+G+CCGGTCTCC+T+GCAGCCTGAAG+C+T+C(SEQ ID NO.6)

/5Biosg/G+T+T+TCAGAAAGC+A+GGGAGGGCCTG+G+T+G(SEQ ID NO.7)

/5Biosg/A+A+G+ATGATCCTT+A+AGATAACTCTT+C+A+T(SEQ ID NO.8)

/5Biosg/C+T+T+GCTGTTTTC+A+TCCATCTTCCT+A+G+T(SEQ ID NO.9)。

本发明人发现,对Lnc-RNA分子Lnc-DC进行抑制后可以恢复乳腺癌他莫昔芬耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。因此,上述Lnc-RNA分子Lnc-DC可以作为设计抗乳腺癌他莫昔芬耐药的药物靶点。本发明提供了一种提高乳腺癌患者预后的方法,所述方法包括给予所述乳腺癌患者Lnc-RNA分子Lnc-DC的gRNA序列。本发明人发现,通过抑制Lnc-RNA分子Lnc-DC,例如通过CRISPR/Cas9方法,可以恢复乳腺癌他莫昔芬耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。在本发明中,可以使用的Dual gRNA(Lnc-DC5’-AGGACCCAGGGTACACAGGG-3’(SEQ ID NO.10);Lnc-DC5’-GGTTACTTAGATAATGCCTG-3’(SEQ ID NO.11))。本领域技术人员可以理解,所述Lnc-RNA分子Lnc-DC抑制剂可以是将Lnc-RNA分子Lnc-DC表达量调低的任何抑制剂,包括gRNA。

因此,本发明还提供了Lnc-DC作为设计抗乳腺癌他莫昔芬耐药药物靶点的用途,以及Lnc-DC在乳腺癌他莫昔芬敏感性预测中的价值。

实施例

1.通过CRISPR/Cas9-SAM文库系统对MCF-7细胞进行转染,进而在激素非依赖性生长环境中筛选出高表达Lnc-DC的MCF-7细胞(称为MCF-7Lnc-DC+细胞)。

发明人根据www.lncrandb.org及www.cuilab.cn/lncrnadisease对已报道的241个LncRNA设计了gRNA(guide RNA,每个LncRNA设计5条gRNA),通过CRISPR/Cas9-SAM文库系统对MCF-7细胞进行转染,提高Lnc-RNA的表达水平。将转染的细胞于不含雌激素培养基培养后,仅少量细胞存活,发明人对存活的细胞进行gRNA的RT-PCR检测后发现,在Lnc-DC sgRNA1aggacccagggtacacaggg(SEQ ID NO.12);Lnc-DC sgRNA2gagctggaatgcaaggccag(SEQ ID NO.13);Lnc-DC sgRNA3gctgtgagtgactgagaaaa(SEQ ID NO.14);Lnc-DC sgRNA4gtcagaggagggcgttccct(SEQ ID NO.15);Lnc-DC sgRNA5aggtaatgtagaaggaccca(SEQ ID NO.16)中,第一条Lnc-DC表达上升最为明显,存活的细胞成为MCF-7lnc-DC+细胞。

MCF-7细胞从ATCC细胞库获得。将MCF-7细胞培养于RPMI1640(Thermo Fisher Scientific)培养基(含10%胎牛血清,血清来源于(Sigma-Aldrich公司),培养基加入2mM L-谷氨酰胺,100U/ml青霉素及100μg/ml的链霉素。

在雌激素剥夺的生长研究中,细胞培养于不含酚红的RPMI1640(Thermo Fisher Scientific)培养基中,同时培养基加入5%炭-剥夺的FBS(Thermo Fisher Scientific),2mM L-谷氨酰胺,100U/ml青霉素及100μg/ml的链霉素。

结果显示,通过CRISPR/Cas9-SAM文库系统对MCF-7细胞进行转染后(转染流程参见图1),在激素剥夺环境中绝大部分MCF-7细胞死亡,少量存活的MCF-7细胞进行gRNA的RT-PCR检测后发现,Lnc-DC表达升高最为明显,参见图2。图2中示出了文库转染后,无雌激素环境细胞培养,显示Lnc-DC表达升高最明显。他莫昔芬耐药的乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7R)高表达Lnc-DC,参见图3。

2.构建他莫昔芬耐药的MCF-7细胞系(称为MCF-7R)

采用高浓度他莫昔芬诱导MCF-7的他莫昔芬耐药细胞株。取对数生长期的MCF-7细胞约107个,接种于直径为10cm的培养皿,待细胞生长稳定后加入10μmol/L的他莫昔芬,48-72h换液后加入等浓度的他莫昔芬。2个月后,通过有限稀释法获得乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药的单克隆细胞株(称为MCF-7R细胞),进而在无药物干预下进行扩增。为了维持MCF-7R细胞的耐药性,后期培养于含2μmol/L的他莫昔芬培养液中。

3.MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+细胞,通过Annexin-V-7-AAD及TUNEL实验检测比较三种细胞对他莫昔芬的抗凋亡能力。

(1)AnnexinV-7-AAD/PI检测法。

1)MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+贴壁细胞消化至单细胞悬液,取1×106细胞重悬于100μl Annexin-V染色液,室温孵育15-20min;

2)加入10μl PI/7-AAD后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟;

3)1小时内用FACScan Calibur流式细胞仪收集荧光信号;

4)FlowJo分析数据分析数据。

(2)TUNEL检测法

1)将目的细胞甩片于多聚赖氨酸包被的载玻片;

2)PBS漂洗两次,5min;

3)使样本周围区域水分蒸发干,加入50μl TUNEL反应混合液于样品(孵育使样品覆盖上盖玻片防止蒸发);

4)在湿盒中避光孵育60min,37℃;

5)PBS漂洗两次,5min,荧光显微镜下观察。激发光波长450-500nm。

比较MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬凋亡诱导的敏感性,显示相比于普通MCF-7细胞,MCF-7R细胞及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬凋亡诱导敏感性显著下降,参考图4(Annxexin-V-7-AAD染色,显示不同类型细胞对于他莫昔芬的耐药性),图5(TUNEL染色,显示不同类型细胞对于他莫昔芬的耐药性)。

4.RT-PCR检测MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+细胞中的Lnc-DC表达水平。

(1)TRIzol总RNA抽提

1)MCF-7、MCF-7R及MCF-7lnc-DC+细胞中抽提:吸去培养基,2ml PBS洗涤2次,加入1ml TRIzol,移液枪反复吹打20下,确保细胞全部裂解,然后吸至1.5ml eppendorf管中;

2)室温放置5分钟,使样品充分裂解,加入0.2ml氯仿,猛烈晃动10秒钟,室温放置2分钟;

3)12000g 4℃离心15分钟,吸取上层无色水相移至新的eppendorf管,加入0.5ml异丙醇,颠倒混匀,冰上放置10分钟;

4)12000g 4℃离心10分钟,可见管底的RNA沉淀,小心吸去上清;

5)加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制),颠倒混匀,7500g 4℃离心5分钟,小心吸去上清;

6)加入20μl DEPC水溶解,Nanodrop分光光度计定量并质检,-80℃保存待用。

(2)Lnc-RNA定量PCR检测

1)TaqMan Lnc-RNA expression assays试剂盒逆转录:

吸取1-10ng量的RNA(5μl),混于3μl引物、0.15μl 100mM dNTP、1μlMultiScribe Reverse Transcriptase、1.5μl 10×Reverse Transcription Buffer、0.19μl RNase Inhibitor、4.16μl Nuclease-free water,充分混匀,8000rpm离心3秒钟后放置于冰上,引物为Lnc-DC-RT-5.1ccttccaacagcaacatgaa(SEQ ID NO.2)和Lnc-DC-RT-3.1tgtccttaccctgcaacaca(SEQ ID NO.3);

2)PCR设置:

3)吸取逆转录产物1.33μl混于1μl 20×TaqMan MicroRNA Assay、10μlTaqMan 2×Universal PCR Master Mix、7.67μl Nuclease-free water,充分混匀,8000rpm离心3秒钟;

4)PCR设置:

5)每个样本均以GAPDH为内参基因,以2-ΔCT mean计算法来分析基因表达水平。

5.用Dual gRNA处理MCF-7R细胞及MCF-7lnc-DC+细胞

针对Lnc-DC的Dual gRNA序列为Lnc-DC Dual-T15’-AGGACCCAGGGTACACAGGG-3’(SEQ ID NO.10),Lnc-DCDual-T2 5’-GGTTACTTAGATAATGCCTG-3’(SEQ ID NO.11)转染后,7x 105细胞种于6孔板,3μl(40nM)siRNA Lnc-DC稀释于100μlOpti-MEM(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)及5μl HiPerFectTransfection Reagent。混合10min后,将mix滴入细胞,孵育24h后重复上述步骤;48h后,RT-PCR检测lnc-DC表达水平。

重复步骤3,通过Annexin-V-7-AAD及TUNEL实验检测比较三种细胞对他莫昔芬的抗凋亡能力。

将这些细胞用RNAi处理,MCF-7R细胞及MCF-7lnc-DC+细胞对他莫昔芬凋亡诱导敏感性逆转50%。

6、通过GEO数据库(GSE#16391)中患者中位无进展生存期(36.39月),将患者分为早复发及晚复发两组,分析两组患者Lnc-DC表达水平。表达水平测试的步骤如下:通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE#16391数据包,在数据表中搜索Lnc-DC对应的基因芯片号,进一步搜索该芯片号对应的所有样本的荧光信号值即基因表达值,根据表达差异取中位数确定Lnc-DC高表达及低表达组,进行生存分析。

根据GSE#16391数据库中患者中位无进展生存期(36.39月),将患者分为早复发及晚复发两组,分析显示较早复发的患者Lnc-DC表达水平明显高于较晚复发的患者,参见图6。

本发明实施例中的结果表明,Lnc-DC高表达可以主动引起乳腺癌ER阳性MCF-7细胞的他莫昔芬耐药性,抑制他莫昔芬对乳腺癌MCF-7的凋亡诱导作用,此外,高表达Lnc-DC的乳腺癌患者肿瘤复发时间较短,提示Lnc-DC对乳腺癌患者他莫昔芬敏感性具有预测作用,测定乳腺癌患者中非编码Lnc-RNA分子Lnc-DC的表达情况,可以用于筛选乳腺癌患者的预后;此外,抑制Lnc-DC表达可以显著改善MCF-7对他莫昔芬的敏感性,非编码Lnc-RNA分子Lnc-DC可以用于制备提高乳腺癌患者预后的药剂。因此,本发明为设计抗乳腺癌他莫昔芬耐药药物提供了新的靶点,并为开发相关检测试剂盒奠定了基础。

>LncDC(SEQ ID NO.1)

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序列表

<110> 浙江省人民医院

<120> 一种非编码RNA分子lnc-DC在预测乳腺癌预后中的应用

<130> CF170513S

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6902

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gaccaaagta aaactccgtc caaaaaaaaa agaaaaaaaa aacgaaatgg aaatttccag 60

aaataaacaa ttcatacatt tcaacttgct gctgttctga gtagcgtgat gaaatcttgc 120

gccatcccac ttcattctgc ctggaatgtg aatcatccct tagtcaagca tatccacgct 180

ttatatgcta cccacccgtt agtcacttaa taaccatctc agttatgaga tccactgtcc 240

cagtgcttgt gttcaagtaa cctttatttt gcttagtggt ctcaaagcat aagagtagtg 300

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tgcctaattt ataaatttac tttatcataa ggatgtattt ataggacaga acacatatat 420

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atcattgtag ttaacactta ctgaatgctt tctatgtgtc agcactttat gtgaccctct 600

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tctgagaaaa agacaaaaaa aattttgccc gagacctgct gttttgggga cctggatcca 1260

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attttttgag atggagtctc cctctgttgc ccaggctggt gtgcagtggt gcgatctcgg 1680

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ctttacctga ttatgtctct gggtctttct ggaacttttc tcatctgtaa aaaggggccc 3420

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再多了解一些
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