本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测cvb3的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术：
病毒性心肌炎(viralmyocarditis，vmc)是由病毒引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变。近年来vmc在我国的发病呈上升趋势，已成为儿童和青少年猝死的主要原因之一。部分患者呈自限性病程，重者可出现心力衰竭、心源性休克和猝死，部分患者可演变为扩张型心肌病，致死率高达50％。肠道病毒属的柯萨奇病毒a组、柯萨奇病毒b组、艾可病毒、脊髓灰质炎病毒等为常见的致心肌炎病毒，其中柯萨奇病毒b组3型(cvb3)是最主要的病毒。目前对大部分病原无有效的疫苗及治疗手段，研发相关早期诊断方法对vmc的防治具有重要意义。目前常用的病毒学实验室诊断方法包括免疫学方法、病毒分离培养等方法，但都存在难以早期诊断、敏感度低等缺陷。荧光定量pcr技术方法，在核酸的水平上对病毒进行检测，对人体内所具有的相应核酸可达到早期检测的目的，为vmc的早期诊断提供了准确、快速、高效、敏感方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测cvb3的荧光定量pcr引物，该引物特异性好，检测灵敏精确。
本发明的另一个目的在于提供一种检测cvb3的荧光定量pcr探针，该探针特异性好，检测灵敏精确。
本发明的还一个目的在于提供一种检测cvb3的荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒利用荧光标记的探针与病毒靶序列特异性结合来指示扩增产物的有无，能检测cvb3是否存在，还可以通过梯度标准品的对照计算病毒的拷贝数的大小，准确性好，灵敏度高。
本发明的再一个目的在于提供一种检测cvb3的荧光定量pcr方法，该方法具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测cvb3的荧光定量pcr引物，所述引物的核苷酸序列如seqid1和seqid2所示，具体如下：
seqid1coxsackievirusb3-f：5’-ccattcaaggtccgagtca-3’
seqid2coxsackievirusb3-r：5’-gcttgtcgtggtgttaatac-3’。
所述引物的设计步骤如下：由于cvb3有较多的变异株，并且存在较多的snp位点，为此我们选择病毒株的保守结构区间进行相关引物设计。根据分析，rhv为cvb3基因组的保守结构域，序列相对较为保守，可以保证引物设计针对cvb3的特异性。vp1蛋白是科萨奇特征蛋白，根据蛋白的位置，可知coxsackievirusb3的vp1蛋白与其rhv结构域保守序列有重叠区域，因此可以从vp1上寻找保守区段设计引物。从ncbi下载coxsackievirusb3的基因组全序列(genbank：idm33854.1)，vp1蛋白位置818-1101，vp1蛋白的序列如seqid5所示。通过smart网站分析确定病毒的rhv结构域的蛋白位置为849-1017，经过优选，得到上述引物coxsackievirusb3-f和coxsackievirusb3-r。
在优选引物条件下，所扩增出的目的片段如seqid3所示，具体为：
seqid3coxsackievirusb3target
ccattcaaggtccgagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggagtataaaaactcaggtgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgacaagc。
本发明的另一个目的通过下述技术方案实现：一种检测cvb3的荧光定量pcr探针，所述探针的核苷酸序列为：coxsackievirusb3：5’agagaacttcctatgtaggtcagc-3’，所述探针的5’端标记荧光基团，3’标记淬灭基团。
优选的，所述荧光基团为fam，vic，cy5或joe中的一种。
优选的，所述淬灭基团为bhq，eclipse中的一种。
本发明的还一个目的通过下述技术方案实现：一种检测cvb3的荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。
本发明的再一个目的通过下述技术方案实现：一种用于非治疗目的的检测cvb3的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
(1)提取样本rna：采用磁珠法提取样本rna；
(2)反应液配置：将待测样品的病毒rna、同样量的阴性标准品和系列稀释的阳性标准品分别配制成pcr反应液；
(3)荧光定量pcr：将上述pcr反应液进行pcr扩增，通过比较待测样品和相应标准品的ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
优选的，所述步骤(1)具体为：
(1.1)样本处理：将样品在超净工作台转入无酶ep管中，加入1ml裂解液，并旋涡振荡至无明显颗粒物，室温静止4-6min；
(1.2)分离rna层：向ep管中加入180-220μl氯仿，盖紧ep管盖，振荡混合溶液至乳浊液，室温静止4-6min，然后在3-5℃温度下以10000-14000g离心力离心8-12min，从离心机中取出ep管，内部匀浆液分为三层，小心吸取最上层无色溶液并转移到新的ep管中；
(1.3)核酸结合：向ep管中加入350-450μl异丙醇和15-25μl提前摇晃均匀的磁珠悬浮液，高速旋涡振荡4-6min；
(1.4)磁性分离：将ep管置于磁力架上静置15-25s至磁珠吸附完全，如ep管中有磁珠残液，可保持ep管在磁力架上，整体上下颠倒2-3次使磁珠吸附完全；去上清液。
(1.5)一次清洗：向ep管中加入500-700μl清洗液a，用移液枪吹散磁珠，旋涡振荡1.5-2.5min，参照步骤(1.4)进行磁性分离；
(1.6)二次清洗：使用500-700μl清洗液b，参照步骤(1.5)操作两次；
(1.7)洗脱：将弃尽上清液的ep管保持于磁力架上，打开ep管室温晾干6-10min至无明显乙醇味；向ep管中加入30-100μl洗脱液，旋涡振荡至磁珠全部分散于液相中，56-60℃水浴4-6min；洗脱完毕，用移液枪将洗脱液转移至另一干净ep管中；将所提取的rna反应液置于超低温冰箱待用。
更为优选的，所述步骤(1)具体为：
(1.1)样本处理：将样品在超净工作台转入无酶ep管中，加入1ml裂解液，并旋涡振荡至无明显颗粒物，室温静止5min；
(1.2)分离rna层：向ep管中加入200μl氯仿，盖紧ep管盖，振荡混合溶液至乳浊液，室温静止5min，然后在4℃温度下以12000g离心力离心10min，从离心机中取出ep管，内部匀浆液分为三层，小心吸取最上层无色溶液并转移到新的ep管中；
(1.3)核酸结合：向ep管中加入400μl异丙醇和20μl提前摇晃均匀的磁珠悬浮液，高速旋涡振荡5min；
(1.4)磁性分离：将ep管置于磁力架上静置20s至磁珠吸附完全，如ep管中有磁珠残液，可保持ep管在磁力架上，整体上下颠倒2-3次使磁珠吸附完全；去上清液。
(1.5)一次清洗：向ep管中加入600μl清洗液a，用移液枪吹散磁珠，旋涡振荡2min，参照步骤(1.4)进行磁性分离；
(1.6)二次清洗：使用600μl清洗液b，参照步骤(1.5)操作两次；
(1.7)洗脱：将弃尽上清液的ep管保持于磁力架上，打开ep管室温晾干8min至无明显乙醇味；向ep管中加入60μl洗脱液，旋涡振荡至磁珠全部分散于液相中，58℃水浴5min；洗脱完毕，用移液枪将洗脱液转移至另一干净ep管中；将所提取的rna反应液置于超低温冰箱待用。
优选的，所述步骤(2)中，pcr反应液包括：10×pcr缓冲液：2.5μl、25mmmgcl2：2.0μl、2.5mmdntp：2.0μl、10μmcvb3-f：2.0μl、10μmcvb3-r：2.0μl、10μmcvb3-p：2.0μl、模板rna2.0μl、pcr增强剂1.0μl、5u/μltaq酶：0.5μl、纯净水11.0μl。
优选的，所述步骤(3)中，pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min，60℃逆转录15min，循环过程使用三步法扩增：95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，36个循环，72℃彻底延伸5min。
本发明的有益效果在于：本发明的引物和探针特异性好，检测灵敏精确。
本发明的试剂盒利用荧光标记的探针与病毒靶序列特异性结合来指示扩增产物的有无，能检测cvb3是否存在，还可以通过梯度标准品的对照计算病毒的拷贝数的大小，准确性好，灵敏度高。
本发明的方法具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便。
附图说明
图1是本发明的待测样品、阴性标准品和系列稀释的阳性标准品的扩增曲线图(阴性样本不体现曲线)。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)：d.l.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南：吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。
一种检测cvb3的荧光定量pcr引物，所述引物的核苷酸序列为：
coxsackievirusb3-f：5’-ccattcaaggtccgagtca-3’
coxsackievirusb3-r：5’-gcttgtcgtggtgttaatac-3’。
一种检测cvb3的荧光定量pcr探针，所述探针的核苷酸序列为：coxsackievirusb3：5’agagaacttcctatgtaggtcagc-3’，所述探针的5’端标记荧光基团，3’标记淬灭基团。
所述荧光基团为fam，vic，cy5或joe中的一种。
所述淬灭基团为bhq，eclipse中的一种。
一种检测cvb3的荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。
本发明的试剂盒的工作原理：本发明提供的检测cvb3的荧光定量pcr试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(fret)而被3’端非荧光淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化且本底低。在pcr退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，taqdna聚合酶利用其5’端到3’端外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(fret)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与pcr产物的积累量呈比例关系。对cvb3的定量可通过与标准品的循环域值(ct，thresholdcycle)相比较得出。ct值是pcr过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，ct值与起始模板数呈一定比例关系，ct值越小，起始模板数越多，相反，ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的ct值制成标准曲线，再根据待测样品的ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供的cvb3的荧光定量pcr试剂盒中，针对cvb3检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系的优化，并将荧光定量pcr技术和定量检测系统相结合，将其用于cvb3的定量检测。通过优化方案，反复试验，研制出检测cvb3荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出101个拷贝，可以满足快速检测cvb3的要求。
一种用于非治疗目的的检测cvb3的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
(1)提取样本rna：采用磁珠法提取样本rna；
(2)反应液配置：将待测样品的病毒rna、同样量的阴性标准品和系列稀释的阳性标准品分别配制成pcr反应液；
(3)荧光定量pcr：将上述pcr反应液进行pcr扩增，通过比较待测样品和相应标准品的ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
所述步骤(1)具体为：
(1.1)样本处理：将样品在超净工作台转入无酶ep管中，加入1ml裂解液，并旋涡振荡至无明显颗粒物，室温静止4-6min；
(1.2)分离rna层：向ep管中加入180-220μl氯仿，盖紧ep管盖，振荡混合溶液至乳浊液，室温静止4-6min，然后在3-5℃温度下以10000-14000g离心力离心8-12min，从离心机中取出ep管，内部匀浆液分为三层，小心吸取最上层无色溶液并转移到新的ep管中；
(1.3)核酸结合：向ep管中加入350-450μl异丙醇和15-25μl提前摇晃均匀的磁珠悬浮液，高速旋涡振荡4-6min；
(1.4)磁性分离：将ep管置于磁力架上静置15-25s至磁珠吸附完全，如ep管中有磁珠残液，可保持ep管在磁力架上，整体上下颠倒2-3次使磁珠吸附完全；去上清液。
(1.5)一次清洗：向ep管中加入500-700μl清洗液a，用移液枪吹散磁珠，旋涡振荡1.5-2.5min，参照步骤(1.4)进行磁性分离；
(1.6)二次清洗：使用500-700μl清洗液b，参照步骤(1.5)操作两次；
(1.7)洗脱：将弃尽上清液的ep管保持于磁力架上，打开ep管室温晾干6-10min至无明显乙醇味；向ep管中加入30-100μl洗脱液，旋涡振荡至磁珠全部分散于液相中，56-60℃水浴4-6min；洗脱完毕，用移液枪将洗脱液转移至另一干净ep管中；将所提取的rna反应液置于超低温冰箱待用。
更为所述步骤(1)具体为：
(1.1)样本处理：将样品在超净工作台转入无酶ep管中，加入1ml裂解液，并旋涡振荡至无明显颗粒物，室温静止5min；
(1.2)分离rna层：向ep管中加入200μl氯仿，盖紧ep管盖，振荡混合溶液至乳浊液，室温静止5min，然后在4℃温度下以12000g离心力离心10min，从离心机中取出ep管，内部匀浆液分为三层，小心吸取最上层无色溶液并转移到新的ep管中；
(1.3)核酸结合：向ep管中加入400μl异丙醇和20μl提前摇晃均匀的磁珠悬浮液，高速旋涡振荡5min；
(1.4)磁性分离：将ep管置于磁力架上静置20s至磁珠吸附完全，如ep管中有磁珠残液，可保持ep管在磁力架上，整体上下颠倒2-3次使磁珠吸附完全；去上清液。
(1.5)一次清洗：向ep管中加入600μl清洗液a，用移液枪吹散磁珠，旋涡振荡2min，参照步骤(1.4)进行磁性分离；
(1.6)二次清洗：使用600μl清洗液b，参照步骤(1.5)操作两次；
(1.7)洗脱：将弃尽上清液的ep管保持于磁力架上，打开ep管室温晾干8min至无明显乙醇味；向ep管中加入60μl洗脱液，旋涡振荡至磁珠全部分散于液相中，58℃水浴5min；洗脱完毕，用移液枪将洗脱液转移至另一干净ep管中；将所提取的rna反应液置于超低温冰箱待用。
所述步骤(2)中，pcr反应液包括：10×pcr缓冲液：2.5μl、25mmmgcl2：2.0μl、2.5mmdntp：2.0μl、10μmcvb3-f：2.0μl、10μmcvb3-r：2.0μl、10μmcvb3-p：2.0μl、模板rna2.0μl、pcr增强剂1.0μl、5u/μltaq酶：0.5μl、纯净水11.0μl。
所述步骤(3)中，pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min，60℃逆转录15min，循环过程使用三步法扩增：95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，36个循环，72℃彻底延伸5min。
反应结束后，仪器自动保存结果，也可手动记录结果的ct值和结果，并通过标准曲线的产生参数方程，计算相关病毒拷贝数大小。见图1阳性标准品和待测样本的扩增曲线，呈现平滑的s型，显示扩增效率较好。
本发明的试剂盒利用荧光标记的探针与病毒靶序列特异性结合来指示扩增产物的有无，能检测cvb3是否存在，还可以通过梯度标准品的对照计算病毒的拷贝数的大小，准确性好，灵敏度高。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
<110>东莞市第八人民医院；东莞市儿科研究所
<120>一种检测cvb3的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法
<160>5
<210>1
<211>19
<212>rna
<213>人工序列
<400>1
ccattcaaggtccgagtca19
<210>2
<211>20
<212>rna
<213>人工序列
<400>2
gcttgtcgtggtgttaatac20
<210>3
<211>123
<212>rna
<213>人工序列
<400>3
ccattcaaggtccgagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactt60
tacggagtataaaaactcaggtgccaagcggtatgctgaatgggtattaacaccacgaca120
agc123
<210>4
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<400>4
agagaacttcctatgtaggtcagc24
<210>5
<211>852
<212>rna
<213>人工序列
<400>5
ggcccagtggaagacgcgataacagccgctatagggagagttgcggataccgtgggtaca60
gggccaaccaactcagaagctataccagcactcactgctgctgagacgggtcacacgtca120
caagtagtgccgggtgacactatgcagacacgccacgttaagaactaccattcaaggtcc180
gagtcaaccatagagaacttcctatgtaggtcagcatgcgtgtactttacggagtataaa240
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attatgtatgtaccaccaggtggacctgtaccagataaagttgattcatacgtgtggcaa480
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ccgtttttgagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaattttcc600
aggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgctatatgcaagacat660
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gtgaacttccaacccagcggagttaccactactaggcaaagcatcactacaatgacaaat840
acgggcgcattt852