本发明涉及一种基因检测方法，尤其涉及一种抑郁症用药相关基因的检测方法及试剂盒。
背景技术：
抑郁症又称抑郁障碍，是常见的精神疾病之一，是由各种原因引起的以抑郁情绪为核心症状的一组心境障碍的疾病，主要表现为情绪的持久低落、意志活动减退、思维迟缓、认知功能损失、睡眠障碍等，严重者伴有反复自杀观念和行为，具有较高的发病率和复发率。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向。据who统计，全球目前约有3.22亿抑郁症患者，患病率为4.4％，有报到称，在我国抑郁症发病率达到了6.1％。有研究表明，抑郁症患者的亲属患病率比普通家庭高10～30倍，且血缘关系越近，患病率越高，由此可见，抑郁症与遗传有密切关联。在抑郁症患者中，仅有30％～45％的患者在抗抑郁药物治疗下可以获得临床症状的缓解，另有10％的患者对任何种类的抗抑郁药物治疗均无效。导致药物治疗出现巨大个体差异的原因，除了传统上的性别、年龄、病理、生理、身高、体重、依从性等方面外，遗传因素的差异性也是重点关注的因素之一，其中药物代谢酶、转运蛋白、受体和其他药物作用靶点的基因多态性是引起药物效应和毒性个体差异的重要原因。药物基因组学是一门研究个体遗传多态性导致药物应答差异的学科。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学的发展也突飞猛进，成为了指导临床个性化用药、评估药物严重不良反应风险的重要工具。然而，现有技术中基于药物基因组学的基因检测方法还存在操作复杂、成本高、不利于推广应用的问题。技术实现要素：鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是一种抑郁症用药相关基因的检测方法及试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种抑郁症用药相关基因的检测方法，其包括以下步骤：s1、根据抑郁症药物的特征，确定影响药效的作用靶点的基因；s2、根据确定的基因选择对应的引物组；s3、提取检测对象的生物样本；s4、将引物组以及提取的生物样本置于含有pgx-pcr酶的pcr反应体系中进行扩增；s5、将生物样本、扩增产物进行纯化处理后，进行二代测序分析。优选地，所述作用靶点的基因包括：cyp2d6、cyp2c19、cyp1a2、cyp3a4、abcb1、htr2a、comt、cyp2b6、htr1a、mc4r、slc6a4、adcy9、adra2a、ankk1、epm2a、fkbp5、gadl1、gnb3、grik4、ugt2b15。优选地，所述作用靶点为所列各基因上的共79个snp位点。优选地，所述79个snp位点的信息如下表1所示：表1。优选地，所述引物组包括：abcb1-1-f、abcb1-1-r、abcb1-2-f、abcb1-2-r、adcy9-f、adcy9-r、adra2a-f、adra2a-r、ankk1-f、ankk1-r、comt-1-f、comt-1-r、comt-2-f、comt-2-r、cyp1a2-1-f、cyp1a2-1-r、cyp1a2-2-f、cyp1a2-2-r、cyp1a2-3-f、cyp1a2-3-r、cyp1a2-4-f、cyp1a2-4-r、cyp1a2-5-f、cyp1a2-5-r、cyp1a2-6-f、cyp1a2-6-r、cyp1a2-7-f、cyp1a2-7-r、cyp1a2-8-f、cyp1a2-8-r、cyp2b6-1-f、cyp2b6-1-r、cyp2b6-2-f、cyp2b6-2-r、cyp2c19-1-f、cyp2c19-1-r、cyp2c19-2-f、cyp2c19-2-r、cyp2c19-3-f、cyp2c19-3-r、cyp2c19-4-f、cyp2c19-4-r、cyp2c19-5-f、cyp2c19-5-r、cyp2c19-6-f、cyp2c19-6-r、cyp2c19-7-f、cyp2c19-7-r、cyp2d6-1-f、cyp2d6-1-r、cyp2d6-2-f、cyp2d6-2-r、cyp2d6-3-f、cyp2d6-3-r、cyp2d6-4-f、cyp2d6-4-r、cyp2d6-5-f、cyp2d6-5-r、cyp2d6-6-f、cyp2d6-6-r、cyp2d6-7-f、cyp2d6-7-r、cyp2d6-8-f、cyp2d6-8-r、cyp2d6-9-f、cyp2d6-9-r、cyp2d6-10-f、cyp2d6-10-r、cyp2d6-11-f、cyp2d6-11-r、cyp2d6-12-f、cyp2d6-12-r、cyp3a4-1-f、cyp3a4-1-r、cyp3a4-2-f、cyp3a4-2-r、cyp3a4-3-f、cyp3a4-3-r、cyp3a4-4-f、cyp3a4-4-r、cyp3a4-5-f、cyp3a4-5-r、cyp3a4-6-f、cyp3a4-6-r、epm2a-f、epm2a-r、fkbp5-f、fkbp5-r、gadl1-f、gadl1-r、gnb3-f、gnb3-r、grik4-f、grik4-r、htr1a-1-f、htr1a-1-r、htr1a-2-f、htr1a-2-r、htr2a-1-f、htr2a-1-r、htr2a-2-f、htr2a-2-r、htr2a-3-f、htr2a-3-r、mc4r-1-f、mc4r-1-r、mc4r-2-f、mc4r-2-r、ugt2b15-f、ugt2b15-r、slc6a4-f、slc6a4-r。优选地，所述引物组中各引物的序列如seqidno.1-seqidno.56所示。优选地，所述pgx-pcr酶包括一个taq酶和一个高保真酶。优选地，所述taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5。优选地，所述步骤s5中，纯化分析包括如下步骤：s51、取出纯化磁珠室温平衡30分钟，充分涡旋混匀；s52、取15μlpcr产物至一新的离心管，向pcr产物中补加无核酸酶水至100μl，加入60μl混匀后的磁珠，吹打10次以充分混匀；s53、室温孵育5分钟；s54、将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清；s55、转移上清液至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠；s56、向s55中的离心管中加入40μl混匀好的磁珠，吹打10次以充分混匀；s57、室温孵育5分钟；s58、将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清；s59、弃上清液，勿扰动磁珠；s510、保持离心管在磁力架上，各加入200μl新配制的80％乙醇，勿扰动磁珠；s511、至少静置30秒，后吸去上清液；s512、重复步骤s510-s511，两次80％乙醇清洗；s513、将离心管从磁力架取下，室温干燥5-10分钟，确保乙醇无残留，磁珠不过分干燥；s514、用50μl10mmtris-hcl，ph8.0重悬磁珠；重悬时轻轻吹打混匀，室温静置5分钟后，将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清，转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠；s515、纯化后的文库定量采用2.0fluorometer或仪器；s516、特异性纯化后的文库使用仪器或传统凝胶电泳进行分析。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种抑郁症用药相关基因检测的试剂盒，其包括：dna位点富集反应组件，其由引物组组成；pgx-pcr酶，由一个taq酶和一个高保真酶组成；p5引物和p7引物；质控品；以及阴性质控品。与现有技术相比，本发明的技术效果为：可针对多个靶序列在较短时间完成文库构建，仅需要对pcr产物进行简单纯化，就可以进行测序分析。有效的解决了在临床应用中，需要对样本进行步骤繁冗且耗时长的处理的问题，进而为抑郁症用药进行指导。附图说明图1为pcr产物长度的分布频率；图2为检测所覆盖的基因位点的详细信息。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明提供一种抑郁症用药相关基因的检测方法，其包括以下步骤：s1、根据抑郁症药物的特征，确定影响药效的作用靶点的基因。其中，所述作用靶点的基因包括：cyp2d6、cyp2c19、cyp1a2、cyp3a4、abcb1、htr2a、comt、cyp2b6、htr1a、mc4r、slc6a4、adcy9、adra2a、ankk1、epm2a、fkbp5、gadl1、gnb3、grik4、ugt2b15。进一步地，基于所列的各基因，所述作用靶点涉及所列各基因上的共79个snp位点。具体地，所述79个snp位点的信息如下表1所示：表1。s2、根据确定的基因选择对应的引物组。其中，所述引物组由多个引物组成，任一引物的引物结构由三部分组成，即5’端引物—loop引物1/loop引物2—3’端引物。在一个实施方式中，所述引物组包括：abcb1-1-f、abcb1-1-r、abcb1-2-f、abcb1-2-r、adcy9-f、adcy9-r、adra2a-f、adra2a-r、ankk1-f、ankk1-r、comt-1-f、comt-1-r、comt-2-f、comt-2-r、cyp1a2-1-f、cyp1a2-1-r、cyp1a2-2-f、cyp1a2-2-r、cyp1a2-3-f、cyp1a2-3-r、cyp1a2-4-f、cyp1a2-4-r、cyp1a2-5-f、cyp1a2-5-r、cyp1a2-6-f、cyp1a2-6-r、cyp1a2-7-f、cyp1a2-7-r、cyp1a2-8-f、cyp1a2-8-r、cyp2b6-1-f、cyp2b6-1-r、cyp2b6-2-f、cyp2b6-2-r、cyp2c19-1-f、cyp2c19-1-r、cyp2c19-2-f、cyp2c19-2-r、cyp2c19-3-f、cyp2c19-3-r、cyp2c19-4-f、cyp2c19-4-r、cyp2c19-5-f、cyp2c19-5-r、cyp2c19-6-f、cyp2c19-6-r、cyp2c19-7-f、cyp2c19-7-r、cyp2d6-1-f、cyp2d6-1-r、cyp2d6-2-f、cyp2d6-2-r、cyp2d6-3-f、cyp2d6-3-r、cyp2d6-4-f、cyp2d6-4-r、cyp2d6-5-f、cyp2d6-5-r、cyp2d6-6-f、cyp2d6-6-r、cyp2d6-7-f、cyp2d6-7-r、cyp2d6-8-f、cyp2d6-8-r、cyp2d6-9-f、cyp2d6-9-r、cyp2d6-10-f、cyp2d6-10-r、cyp2d6-11-f、cyp2d6-11-r、cyp2d6-12-f、cyp2d6-12-r、cyp3a4-1-f、cyp3a4-1-r、cyp3a4-2-f、cyp3a4-2-r、cyp3a4-3-f、cyp3a4-3-r、cyp3a4-4-f、cyp3a4-4-r、cyp3a4-5-f、cyp3a4-5-r、cyp3a4-6-f、cyp3a4-6-r、epm2a-f、epm2a-r、fkbp5-f、fkbp5-r、gadl1-f、gadl1-r、gnb3-f、gnb3-r、grik4-f、grik4-r、htr1a-1-f、htr1a-1-r、htr1a-2-f、htr1a-2-r、htr2a-1-f、htr2a-1-r、htr2a-2-f、htr2a-2-r、htr2a-3-f、htr2a-3-r、mc4r-1-f、mc4r-1-r、mc4r-2-f、mc4r-2-r、ugt2b15-f、ugt2b15-r、slc6a4-f、slc6a4-r。其中，所述引物组中各引物的序列如seqidno.1-seqidno.56所示。所述loop引物1的序列如seqidno.57所示，所述loop引物2的序列如seqidno.58所示。s3、提取检测对象的生物样本。其中，提取的生物样本可以为人体血液样本。s4、将引物组以及提取的生物样本置于含有pgx-pcr酶的pcr反应体系中进行扩增。其中，所述pgx-pcr酶包括一个taq酶和一个高保真酶。优选地，所述taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5。所述pcr反应体系的信息如下表2所示：成分体积pgx-pcr酶12.5μldna引物组1μlp5引物1μlp7引物1μldna(50ng)xμldnase-freewater8.75-xμlbetaine0.75μltotal25μl表2。所述表2中，所述p5引物的序列如seqidno.59所示，所述p7引物的序列如seqidno.60所示。进一步地，进行pcr扩增时，pcr扩增程序如下表3所示：表3。s5、将生物样本、扩增产物进行纯化处理后，进行二代测序分析。其中，纯化分析包括如下步骤：s51、取出纯化磁珠室温平衡30分钟，充分涡旋混匀；s52、取15μlpcr产物至一新的离心管，向pcr产物中补加无核酸酶水至100μl，加入60μl混匀后的磁珠，吹打10次以充分混匀；s53、室温孵育5分钟；s54、将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清；s55、转移上清液至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠；s56、向s55中的离心管中加入40μl混匀好的磁珠，吹打10次以充分混匀；s57、室温孵育5分钟；s58、将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清；s59、弃上清液，勿扰动磁珠；s510、保持离心管在磁力架上，各加入200μl新配制的80％乙醇，勿扰动磁珠；s511、至少静置30秒，后吸去上清液；s512、重复步骤s510-s511，两次80％乙醇清洗；s513、将离心管从磁力架取下，室温干燥5-10分钟，确保乙醇无残留，磁珠不过分干燥；s514、用50μl10mmtris-hcl，ph8.0重悬磁珠；重悬时轻轻吹打混匀，室温静置5分钟后，将离心管置于磁力架上，室温下静置5分钟至溶液澄清，转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠；s515、纯化后的文库定量采用2.0fluorometer或仪器；s516、特异性纯化后的文库使用仪器或传统凝胶电泳进行分析。进一步地，得到的文库采用illumina的仪器进行测序(双端模式)。上述文库产物的检测具体如下：通过采用illumina测序仪(illumina公司)对样本进行检测，每个样本数据量为300m。结果为：选取的50份全血样品经本发明的方法，能够检测到多种snp类型，证明了该方法的特异性。如图1和图2所示，采用同一样本，进行5次重复性实验，所得结果能达到100％的符合率。从而，根据上述具体实例，可知本发明所涉及的检测抑郁症药物基因组用药指导的21个基因共79个位点的检测方法，操作时间少，步骤简便，且能有效的进行文库构建，经纯化后可以直接用于二代测序，可以满足临床上对snp位点突变的准确检测。且与传统测序方法相比，符合率为100％。基于上述检测方法，本发明还提供一种抑郁症用药相关基因检测的试剂盒，其包括：dna位点富集反应组件，其由引物组组成。优选地，引物组共79对引物，即158条引物，浓度均为250μm。pgx-pcr酶，由一个taq酶和一个高保真酶组成。优选地，taq酶和高保真酶的比例为1:1-1:5。p5引物和p7引物。质控品，即已知所检测的snp位点突变信息的标准品。以及阴性质控品，为无核酸水。综上所述，本发明可针对多个靶序列在较短时间完成文库构建，仅需要对pcr产物进行简单纯化，就可以进行测序分析。有效的解决了在临床应用中，需要对样本进行步骤繁冗且耗时长的处理的问题，进而为抑郁症用药进行指导。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12