定量检测RASD1基因表达的引物和探针及其应用的制作方法

文档序号:15457566发布日期:2018-09-15 01:33

本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种定量检测RASD1基因表达的引物和探针及其应用。



背景技术:

RASD1,又名AGS1,DEXRAS1,定位于染色体17p11.2,跨越1958bp,包含2个外显子。RASD1编码蛋白是小G蛋白酶Ras超家族成员之一,可激活G蛋白信号通路。

据文献报道,RASD1蛋白可与神经元一氧化氮合成酶配体蛋白CAPON、核接头蛋白FE65相互作用,影响阿尔茨海默症淀粉样前体蛋白的作用。RASD1基因可能参与了地塞米松诱导的细胞形态、生长、细胞外基质相互作用的改变。目前研究发现RASD1在乳腺癌、肺癌、肾癌等肿瘤细胞中表达异常。在胶质瘤细胞中,RASD1具有抑制细胞迁移的作用。此外,RASD1基因的表观遗传学改变引起基因表达失活,与多发性骨髓瘤细胞对地塞米松耐药密切相关。

目前尚无RASD1在白血病中的研究报道。



技术实现要素:

本发明的一个目的是提供成套试剂。

本发明提供的成套试剂,包括引物对甲和探针甲;所述引物对甲由引物RASD1-FP和引物RASD1-RP组成;

所述引物对甲的靶序列含有特异DNA片段甲;所述特异DNA片段甲为如下y1)或y2):

y1)序列表的序列7所示的单链DNA分子;

y2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子;

所述探针甲为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子,与所述特异DNA片段甲中的部分区段相同或互补。

上述成套试剂中,

所述引物RASD1-FP为如下a1)或a2):

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子;

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子;

所述引物RASD1-RP为如下b1)或b2):

b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子;

b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子;

所述探针甲为如下c1)或c2):

c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子;

c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套试剂还包括引物对乙和探针乙;所述引物对乙由引物ABL1-F和引物ABL1-R组成;所述引物对ABL1的靶序列含有特异DNA片段乙;

所述特异DNA片段乙为如下z1)或z2):

z1)序列表的序列8所示的单链DNA分子;

z2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子;

所述探针乙为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子,与所述特异DNA片段乙中的部分区段相同或互补。

上述成套试剂中,

所述引物ABL1-F为如下d1)或d2):

d1)序列表中序列4所示的单链DNA分子;

d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子;

所述引物ABL1-R为如下e1)或e2):

e1)序列表中序列5所示的单链DNA分子;

e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子;

所述探针乙为如下f1)或f2):

f1)序列表中序列6所示的单链DNA分子;

f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。

和/或,所述探针甲的末端具有荧光标记;

和/或,所述探针甲的5’末端和/或3’末端具有荧光标记;

和/或,所述探针甲的5’末端具有FAM荧光标记,3’末端具有BHQ荧光标记;

和/或,所述成套试剂中,引物RASD1-FP、引物RASD1-RP和探针甲的摩尔比为40:40:25。

和/或,所述探针乙的末端具有荧光标记;

和/或,所述探针乙的5’末端和/或3’末端具有荧光标记;

和/或,所述探针乙的5’末端具有FAM荧光标记,3’末端具有TAMRA荧光标记;

和/或,所述成套试剂中,引物ABL1-F、引物ABL1-R和探针ABL1-probe的摩尔比为40:40:25。

上述成套试剂还包括阳性对照质粒和/或内参对照质粒;

所述阳性对照为BV173细胞的cDNA;

所述内参对照质粒为向克隆载体或表达载体插入序列表中序列8所示的双链DNA分子,得到的重组质粒。所述克隆载体具体可为pMD18-T载体。

上述成套试剂在制备产品中的应用也是本发明保护的范围;所述产品的功能为如下h1)-h8)中至少一种:

h1)辅助鉴定急性淋巴细胞白血病;

h2)辅助鉴定待测者是否为急性淋巴细胞白血病患者;

h3)辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞;

h4)检测RASD1基因;

h5)检测RASD1基因的表达水平;

h6)辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险;

h7)辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果;

h8)辅助预测急性淋巴细胞白血病的发生和/或病程进展。

上述任一所述成套试剂的制备方法也属于本发明的保护范围。上述任一所述成套试剂的制备方法可为将引物RASD1-FP和/或引物RASD1-RP和/或探针RASD1-probe和/或引物ABL1-F和/或引物ABL1-R和/或探针ABL1-probe和/或阳性对照细胞的cDNA和/或内参对照质粒分别单独包装。

本发明的另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品,包括上述成套试剂。

上述产品的功能为如下h1)-h8)中至少一种:

h1)辅助鉴定急性淋巴细胞白血病;

h2)辅助鉴定待测者是否为急性淋巴细胞白血病患者;

h3)辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞;

h4)检测RASD1基因;

h5)检测RASD1基因的表达水平。

h6)辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险;

h7)辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果;

h8)辅助预测急性淋巴细胞白血病的发生和/或病程进展。

所述产品还包括具有如下f1)或f2)或f3)或f4)或f5)或f6)的数据处理和结论显示功能的装置:

f3)比较待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中RASD1基因的表达水平,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因的表达水平高于正常细胞的cDNA、则待测细胞为或候选为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因的表达水平为正常细胞的cDNA以下,则待测细胞不为或候选不为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞;

f4)比较待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA,则待测细胞为或候选为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平为正常细胞的cDNA以下、则待测细胞不为或候选不为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞;

f5)检测RASD1基因的表达水平,包括以待测样本的cDNA为模板,采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤;

f6)检测RASD1基因参比内参基因的相对表达水平,包括以待测样本的cDNA为模板,采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增的步骤,和,采用上述成套试剂中引物对乙和探针乙进行RQ-PCR扩增的步骤。

RASD1基因作为标志物在开发诊断急性淋巴细胞白血病的试剂中的应用也是本发明保护的范围。

如下g1)或g2)或g3)或g4)也是本发明保护的范围:

g1)辅助鉴定待测者是否为急性淋巴细胞白血病患者的方法,包括如下步骤:检测待测者的cDNA和正常人的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平,如果待测者的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平高于正常人的cDNA,则待测者为或候选为急性淋巴细胞白血病患者,如果待测者的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平为正常人的cDNA以下,则待测者不为或候选不为急性淋巴细胞白血病患者;

g2)辅助鉴定待测细胞是否为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞的方法,包括如下步骤:检测待测细胞的cDNA和正常细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA,则待测细胞为或候选为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞,如果待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平为正常细胞的cDNA以下,则待测细胞不为或候选不为急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞;

g3)检测RASD1基因的表达水平的方法,包括如下步骤:以待测样本的cDNA为模板,采用上述成套试剂中引物对RASD1和探针RASD1-probe进行RQ-PCR扩增;

g4)检测RASD1基因参比内参基因的相对表达水平,包括如下步骤:以待测样本的cDNA为模板,采用上述成套试剂中引物对甲和探针甲进行RQ-PCR扩增,和,采用上述成套试剂中引物对乙和探针乙进行RQ-PCR扩增。

上述任一所述待测者的cDNA中RASD1基因的表达水平高于正常人的cDNA,具体可为待测者的cDNA中RASD1基因的表达水平显著高于正常人的cDNA。

上述任一所述待测者的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平高于正常人的cDNA,具体可为待测者的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平显著高于正常人的cDNA。

上述任一所述待测细胞的cDNA中RASD1基因的表达水平高于正常细胞的cDNA,具体可为待测细胞的cDNA中RASD1基因的表达水平显著高于正常细胞的cDNA。

上述任一所述待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平高于正常细胞的cDNA,具体可为待测细胞的cDNA中RASD1基因参比内参基因的相对表达水平显著高于正常细胞的cDNA。

上述任一所述RASD1基因参比内参基因的相对表达水平具体可为RASD1基因的表达量与内参基因的表达量之比。

上述任一所述RASD1基因的表达量和上述任一所述内参基因的表达量均可为根据标准曲线和CT值得到的拷贝数。

所述内参基因可为人ABL1基因等。

上述任一所述RASD1基因的NCBI基因库序列号为NM_001199989.1。上述任一所述ABL1基因的NCBI基因库序列号为NM_005157。

检测RASD1基因的表达水平的物质在在制备产品中的应用也是本发明保护的范围;所述产品的功能为如下1)-6)中至少一种:

1)辅助鉴定急性淋巴细胞白血病;

2)辅助鉴定待测者是否为急性淋巴细胞白血病患者;

3)辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞;

4)辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险;

5)辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果;

6)辅助预测急性淋巴细胞白血病的发生和/或病程进展。

上述检测RASD1基因的表达水平的物质包括上述成套试剂。

本发明提供的引物对和探针,可以用于定量检测RASD1基因表达水平,从而用于肿瘤细胞系的辅助鉴定或肿瘤患者的辅助诊断,将在医学检测领域发挥重要的作用。

附图说明

图1为阳性对照细胞的RQ-PCR荧光标准曲线。

图2为引物和探针检测细胞系的结果。

图3为引物和探针检测急性淋巴细胞白血病患者的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1、检测RASD1表达的特异引物和探针设计

针对RASD1基因(NCBI基因库序列号:NM_001199989.1,序列7)的设计特异性引物对甲(由上游引物RASD1-FP和下游引物RASD1-RP组成,扩增产物为132bp)和探针甲(探针RASD1-probe):

上游引物RASD1-FP(序列1):5’-GGTCTACCAGCTCGACATCCTC-3’;

下游引物RASD1-RP(序列2):5’-GCACGTCCACGTTCTCCTTG-3’;

探针RASD1-probe(序列3):5’-FAM-CACCCGTTCCCCGCCATGC-BHQ-3’。

针对ABL1基因(内参基因;NCBI基因库序列号:NM_005157,序列8)设计的特异性引物对乙(由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成,扩增产物为124bp)和探针乙(探针ABL1-T-probe):

上游引物ABL1-F(序列表的序列4):5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’;

下游引物ABL1-R(序列表的序列5):5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’;

探针ABL1-T-probe:

5’-FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT–TAMRA-3’(核苷酸序列为序列表的序列6)。

分别合成特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。

实施例2、引物和探针检测阳性对照细胞的灵敏度检测

一、相关阳性对照的制备

1、阳性对照细胞cDNA(高表达RASD1基因的BV173细胞)的制备

BV173细胞(广州吉尼欧公司),提取其细胞的总RNA,反转录得到cDNA,作为阳性对照细胞cDNA。

2、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备

内参对照质粒为将序列8所示的ABL基因插入pMD18-T质粒的ECOR V酶切位点间得到的载体。

3、阴性对照质粒

pMD18-T质粒。

二、检测阳性对照细胞的灵敏度检测

将上述一得到的阳性对照BV173细胞的cDNA用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(以原浓度每微升cDNA拷贝数为106,稀释液分别含有105、104、103、102、101、100个拷贝的cDNA);

将上述一得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(每微升分别含有106、105、104、103、102、101、100个拷贝的ABL基因片段)。

通过测定吸光度值计算ABL基因片段的拷贝数,利用阳性对照BV173细胞的cDNA,参照ABL基因的标准曲线(前期实验获得ABL及RASD1的实时定量PCR扩增效率分别是-3.46及-3.457,结果相近,为减少实验误差,可以仅用ABL基因的标准曲线计算ABL及RASD1的拷贝数),计算阳性对照BV173细胞的cDNA中RASD1基因片段的拷贝数。

将各个阳性对照BV173细胞的cDNA稀释液采用实施例1得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒采用实施例1得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。

PCR反应体系(10μl):上游引物0.3μM,下游引物0.3μM,探针0.2μM,2×TaqMan通用PCR公共体系5μl(ABI公司,美国),质粒或cDNA 1μl;其余为去离子水。

PCR反应条件:50℃2min,1个循环;95℃10min,1个循环;95℃15s,60℃1min,40个循环。

内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线(阈值为0.082)函数为log10ABL1=(Ct-39.110)/-3.460,相关系数均达到0.99以上,检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。

阳性对照BV173细胞的cDNA的RQ-PCR荧光标准曲线见图1(阈值为0.082;横坐标Quantity代表cDNA原始模板的含量,纵坐标代表CT值),函数为log10RASD1=(Ct-39.695)/-3.457,相关系数均达到0.99以上,检测RASD1基因片段的灵敏度至少为10个拷贝。

实施例3、引物和探针检测细胞系及白血病患者

一、试剂盒的组装

试剂盒由如下组件组成:实施例1制备的针对RASD1基因的特异性引物对甲和探针甲、针对ABL1基因的特异性引物对乙和探针乙;实施例2制备的阳性对照细胞的cDNA和内参对照质粒。

二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系

分别检测各个细胞系中的RASD1基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测3次。步骤如下:

1、提取各个细胞的总RNA,反转录为cDNA。

2、以cDNA为模板,用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR;以cDNA为模板,用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。

用内参对照质粒制作标准曲线,以BV173细胞cDNA做阳性对照。对照标准曲线得到各细胞系中RASD1基因和ABL1基因的拷贝数。以RASD1基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示RASD1基因的相对表达水平(%)。

结果见表1和图2,RASD1在健康人基因表达水平为低表达,在急性淋巴细胞白血病细胞系BV173、SUP-B15中高表达,在其它血液肿瘤细胞系中表达均较低。

表1为血液肿瘤细胞系中RASD1基因的表达水平

三、应用步骤一的试剂盒检测急性淋巴白血病患者

分别对若干急性淋巴白血病患者(志愿者,包括158例B-ALL初诊者、214例缓解者、21例难治复发者)及其他志愿者(40例健康人,正常组)进行检测。步骤如下:

1、用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各个志愿者的骨髓标本的RNA(或外周血标本的RNA也可),反转录为cDNA。

2、以cDNA为模板,用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR;以cDNA为模板,用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为阈值为0.082。

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。

用内参对照质粒制作标准曲线,以BV173细胞cDNA做阳性对照。对照标准曲线得到各患者中RASD1基因和ABL1基因的拷贝数。以RASD1基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示RASD1基因的相对表达水平(%)。

结果见图3所示,可以看出,在40例健康人组成的正常组中RASD1低表达,中位值7.59%(范围0.46-38.66%);158例B-ALL初诊者组成的小组中RASD1中位值为80.12%(范围0.17-2822.33%);214例缓解者组成的小组中RASD1中位值3.71%(范围0.01-178.16%),21例难治复发者组成的小组RASD1中位值36.59%(范围1.74-331.68%)。统计结果显示,初诊组及难治复发组的RASD1水平与正常组相比显著升高(p<0.0001),治疗后达血液学缓解的标本RASD1水平与初诊组、难治复发组相比显著下降(p<0.0001)。提示RASD1的水平可能用于预测疾病的发生和病程进展。

因此,可以确定,该引物对和探针可以用来辅助鉴定待测患者是否患有急性淋巴细胞白血病。

序列表

<110>北京大学人民医院

<120>定量检测RASD1基因表达的引物和探针及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtctaccag ctcgacatcc tc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcacgtccac gttctccttg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cacccgttcc ccgccatgc 19

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggagataac actctaagca taactaaagg t 31

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgtagttg cttgggaccc a 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28

<210> 7

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagcaagcg gcctgtgccc agatcctggg agaaccccag ccgagcccag cctagcccga 60

gcccagcccg agcggagccg gagccccaag cccgagccgc gcccagcccg agcagagccc 120

tccagccgct caccccgcgt gccaccccag cgaccctcag ccgctctctg cccttctctc 180

ggccccgcgc ccgccctcgc ggcccctctg cccaatgaaa ctggccgcga tgatcaagaa 240

gatgtgcccg agcgactcgg agctgagtat cccggccaag aactgctatc gcatggtcat 300

cctcggctcg tccaaggtgg gcaagacggc catcgtgtcg cgcttcctca ccggccgctt 360

cgaggacgcc tacacgccta ccatcgagga cttccaccgc aagttctact ccatccgcgg 420

cgaggtctac cagctcgaca tcctcgacac gtccggcaac cacccgttcc ccgccatgcg 480

gcgcctctcc atcctcacag atcctcgaca ccaagtcttg cctcaagaac aaaaccaagg 540

agaacgtgga cgtgcccctg gtcatctgcg gcaacaaggg tgaccgcgac ttctaccgcg 600

aggtggacca gcgcgagatc gagcagctgg tgggcgacga cccccagcgc tgcgcctact 660

tcgagatctc ggccaagaag aacagcagcc tggaccagat gttccgcgcg ctcttcgcca 720

tggccaagct gcccagcgag atgagcccag acctgcaccg caaggtctcg gtgcagtact 780

gcgacgtgct gcacaagaag gcgctgcgga acaagaagct gctgcgggcc ggcagcggcg 840

gcggcggcgg cgacccgggc gacgcctttg gcatcgtggc acccttcgcg cgccggccca 900

gcgtacacag cgacctcatg tacatccgcg agaaggccag cgccggcagc caggccaagg 960

acaaggagcg ctgcgtcatc agctaggagc cccgccgcgc tggcgacaca acctaaggag 1020

gacctttttg ttaagtcaaa tccaacggcc cggtgcgccc caggccggga gcgcgcgcgg 1080

actggcgtct cccctcccgg cgatccgccc ccagcactgg ggaggcgcca ctgaaccgag 1140

aagggacggt catctgctcc ggaaggaaag agaacgggcc aagactggga ctattcccca 1200

cccccggtcc cccattgagg cccgccaccc ccataacttt gggagcgagg gcccagccga 1260

gggtggattt atcttctcaa agacctaaga gtgagcgcgg ggtgggggag ggatgtgaag 1320

ttatccagcc tctgctaggc ttcaagaaac cgtcatgccc gcttgagggt caggacccac 1380

ggggcattat cttgtctgtg attccgggtt gctgtgacag ccggtagagc ctctgccctc 1440

ccgaaactaa gcgggggggc gtgggtcaaa tcatagccaa gtgacttgtt tacatgtgag 1500

tgaaactgca caaaggaaca caaaacaaaa cttgcacttt aacggtagtt ccggtgtcaa 1560

catggacacg aacaaaacct tacccaggtg tttatactgt gtgtgtctga ggtctttaaa 1620

gttattgctt tatttggttt tttaatatac aataaaataa tttaaaatgg aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

<210> 8

<211> 5596

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaacaggcg cgtcccggcc aggcggagac gcggccgcgg ccatgggcgg gcgcgggcgc 60

gcggggcggc ggtgagggcg gctggcgggg ccgggggcgc cgggggggcg cgcgggccga 120

gccgggcctg agccgggccc gcggaccgag ctgggagagg ggttccggcc cccgacgtgc 180

tggcgcggga aaatgttgga gatctgcctg aagctggtgg gctgcaaatc caagaagggg 240

ctgtcctcgt cctccagctg ttatctggaa gaagcccttc agcggccagt agcatctgac 300

tttgagcctc agggtctgag tgaagccgct cgttggaact ccaaggaaaa ccttctcgct 360

ggacccagtg aaaatgaccc caaccttttc gttgcactgt atgattttgt ggccagtgga 420

gataacactc taagcataac taaaggtgaa aagctccggg tcttaggcta taatcacaat 480

ggggaatggt gtgaagccca aaccaaaaat ggccaaggct gggtcccaag caactacatc 540

acgccagtca acagtctgga gaaacactcc tggtaccatg ggcctgtgtc ccgcaatgcc 600

gctgagtatc tgctgagcag cgggatcaat ggcagcttct tggtgcgtga gagtgagagc 660

agtcctggcc agaggtccat ctcgctgaga tacgaaggga gggtgtacca ttacaggatc 720

aacactgctt ctgatggcaa gctctacgtc tcctccgaga gccgcttcaa caccctggcc 780

gagttggttc atcatcattc aacggtggcc gacgggctca tcaccacgct ccattatcca 840

gccccaaagc gcaacaagcc cactgtctat ggtgtgtccc ccaactacga caagtgggag 900

atggaacgca cggacatcac catgaagcac aagctgggcg ggggccagta cggggaggtg 960

tacgagggcg tgtggaagaa atacagcctg acggtggccg tgaagacctt gaaggaggac 1020

accatggagg tggaagagtt cttgaaagaa gctgcagtca tgaaagagat caaacaccct 1080

aacctggtgc agctccttgg ggtctgcacc cgggagcccc cgttctatat catcactgag 1140

ttcatgacct acgggaacct cctggactac ctgagggagt gcaaccggca ggaggtgaac 1200

gccgtggtgc tgctgtacat ggccactcag atctcgtcag ccatggagta cctggagaag 1260

aaaaacttca tccacagaga tcttgctgcc cgaaactgcc tggtagggga gaaccacttg 1320

gtgaaggtag ctgattttgg cctgagcagg ttgatgacag gggacaccta cacagcccat 1380

gctggagcca agttccccat caaatggact gcacccgaga gcctggccta caacaagttc 1440

tccatcaagt ccgacgtctg ggcatttgga gtattgcttt gggaaattgc tacctatggc 1500

atgtcccctt acccgggaat tgacctgtcc caggtgtatg agctgctaga gaaggactac 1560

cgcatggagc gcccagaagg ctgcccagag aaggtctatg aactcatgcg agcatgttgg 1620

cagtggaatc cctctgaccg gccctccttt gctgaaatcc accaagcctt tgaaacaatg 1680

ttccaggaat ccagtatctc agacgaagtg gaaaaggagc tggggaaaca aggcgtccgt 1740

ggggctgtga gtaccttgct gcaggcccca gagctgccca ccaagacgag gacctccagg 1800

agagctgcag agcacagaga caccactgac gtgcctgaga tgcctcactc caagggccag 1860

ggagagagcg atcctctgga ccatgagcct gccgtgtctc cattgctccc tcgaaaagag 1920

cgaggtcccc cggagggcgg cctgaatgaa gatgagcgcc ttctccccaa agacaaaaag 1980

accaacttgt tcagcgcctt gatcaagaag aagaagaaga cagccccaac ccctcccaaa 2040

cgcagcagct ccttccggga gatggacggc cagccggagc gcagaggggc cggcgaggaa 2100

gagggccgag acatcagcaa cggggcactg gctttcaccc ccttggacac agctgaccca 2160

gccaagtccc caaagcccag caatggggct ggggtcccca atggagccct ccgggagtcc 2220

gggggctcag gcttccggtc tccccacctg tggaagaagt ccagcacgct gaccagcagc 2280

cgcctagcca ccggcgagga ggagggcggt ggcagctcca gcaagcgctt cctgcgctct 2340

tgctccgcct cctgcgttcc ccatggggcc aaggacacgg agtggaggtc agtcacgctg 2400

cctcgggact tgcagtccac gggaagacag tttgactcgt ccacatttgg agggcacaaa 2460

agtgagaagc cggctctgcc tcggaagagg gcaggggaga acaggtctga ccaggtgacc 2520

cgaggcacag taacgcctcc ccccaggctg gtgaaaaaga atgaggaagc tgctgatgag 2580

gtcttcaaag acatcatgga gtccagcccg ggctccagcc cgcccaacct gactccaaaa 2640

cccctccggc ggcaggtcac cgtggcccct gcctcgggcc tcccccacaa ggaagaagct 2700

ggaaagggca gtgccttagg gacccctgct gcagctgagc cagtgacccc caccagcaaa 2760

gcaggctcag gtgcaccagg gggcaccagc aagggccccg ccgaggagtc cagagtgagg 2820

aggcacaagc actcctctga gtcgccaggg agggacaagg ggaaattgtc caggctcaaa 2880

cctgccccgc cgcccccacc agcagcctct gcagggaagg ctggaggaaa gccctcgcag 2940

agcccgagcc aggaggcggc cggggaggca gtcctgggcg caaagacaaa agccacgagt 3000

ctggttgatg ctgtgaacag tgacgctgcc aagcccagcc agccgggaga gggcctcaaa 3060

aagcccgtgc tcccggccac tccaaagcca cagtccgcca agccgtcggg gacccccatc 3120

agcccagccc ccgttccctc cacgttgcca tcagcatcct cggccctggc aggggaccag 3180

ccgtcttcca ccgccttcat ccctctcata tcaacccgag tgtctcttcg gaaaacccgc 3240

cagcctccag agcggatcgc cagcggcgcc atcaccaagg gcgtggtcct ggacagcacc 3300

gaggcgctgt gcctcgccat ctctaggaac tccgagcaga tggccagcca cagcgcagtg 3360

ctggaggccg gcaaaaacct ctacacgttc tgcgtgagct atgtggattc catccagcaa 3420

atgaggaaca agtttgcctt ccgagaggcc atcaacaaac tggagaataa tctccgggag 3480

cttcagatct gcccggcgac agcaggcagt ggtccagcgg ccactcagga cttcagcaag 3540

ctcctcagtt cggtgaagga aatcagtgac atagtgcaga ggtagcagca gtcaggggtc 3600

aggtgtcagg cccgtcggag ctgcctgcag cacatgcggg ctcgcccata cccgtgacag 3660

tggctgacaa gggactagtg agtcagcacc ttggcccagg agctctgcgc caggcagagc 3720

tgagggccct gtggagtcca gctctactac ctacgtttgc accgcctgcc ctcccgcacc 3780

ttcctcctcc ccgctccgtc tctgtcctcg aattttatct gtggagttcc tgctccgtgg 3840

actgcagtcg gcatgccagg acccgccagc cccgctccca cctagtgccc cagactgagc 3900

tctccaggcc aggtgggaac ggctgatgtg gactgtcttt ttcatttttt tctctctgga 3960

gcccctcctc ccccggctgg gcctccttct tccacttctc caagaatgga agcctgaact 4020

gaggccttgt gtgtcaggcc ctctgcctgc actccctggc cttgcccgtc gtgtgctgaa 4080

gacatgtttc aagaaccgca tttcgggaag ggcatgcacg ggcatgcaca cggctggtca 4140

ctctgccctc tgctgctgcc cggggtgggg tgcactcgcc atttcctcac gtgcaggaca 4200

gctcttgatt tgggtggaaa acagggtgct aaagccaacc agcctttggg tcctgggcag 4260

gtgggagctg aaaaggatcg aggcatgggg catgtccttt ccatctgtcc acatccccag 4320

agcccagctc ttgctctctt gtgacgtgca ctgtgaatcc tggcaagaaa gcttgagtct 4380

caagggtggc aggtcactgt cactgccgac atccctcccc cagcagaatg gaggcagggg 4440

acaagggagg cagtggctag tggggtgaac agctggtgcc aaatagcccc agactgggcc 4500

caggcaggtc tgcaagggcc cagagtgaac cgtcctttca cacatctggg tgccctgaaa 4560

gggcccttcc cctcccccac tcctctaaga caaagtagat tcttacaagg ccctttcctt 4620

tggaacaaga cagccttcac ttttctgagt tcttgaagca tttcaaagcc ctgcctctgt 4680

gtagccgccc tgagagagaa tagagctgcc actgggcacc tgcgcacagg tgggaggaaa 4740

gggcctggcc agtcctggtc ctggctgcac tcttgaactg ggcgaatgtc ttatttaatt 4800

accgtgagtg acatagcctc atgttctgtg ggggtcatca gggagggtta ggaaaaccac 4860

aaacggagcc cctgaaagcc tcacgtattt cacagagcac gcctgccatc ttctccccga 4920

ggctgcccca ggccggagcc cagatacggg ggctgtgact ctgggcaggg acccggggtc 4980

tcctggacct tgacagagca gctaactccg agagcagtgg gcaggtggcc gcccctgagg 5040

cttcacgccg ggagaagcca ccttcccacc ccttcatacc gcctcgtgcc agcagcctcg 5100

cacaggccct agctttacgc tcatcaccta aacttgtact ttatttttct gatagaaatg 5160

gtttcctctg gatcgtttta tgcggttctt acagcacatc acctctttgc ccccgacggc 5220

tgtgacgcag ccggagggag gcactagtca ccgacagcgg ccttgaagac agagcaaagc 5280

gcccacccag gtcccccgac tgcctgtctc catgaggtac tggtcccttc cttttgttaa 5340

cgtgatgtgc cactatattt tacacgtatc tcttggtatg catcttttat agacgctctt 5400

ttctaagtgg cgtgtgcata gcgtcctgcc ctgccccctc gggggcctgt ggtggctccc 5460

cctctgcttc tcggggtcca gtgcattttg tttctgtata tgattctctg tggttttttt 5520

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再多了解一些
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