一种采集和保存人痕量粪便样本的方法与流程

本发明涉及采集和保存人痕量粪便样本的方法。

背景技术：

随着生活质量的改善，个人健康越来越受到人们的普遍关注。现代医学认为，“健康”不仅仅是躯体无疾病发生，而是人与社会、与自然环境之间的一种动态平衡状态。“亚健康状态”是国际医学界的新概念，指随着社会经济的发展，在各种综合因素下产生的无器质性病变的一些功能性改变，临床症状多样，目前尚无统一的诊断及治疗标准。亚健康状态的提出标志着人类对疾病的策略从治疗转向预防的一个根本性的改变。研究表明，肠道菌群的组成结构与人类健康息息相关。当人处于“亚健康状态时”，其体内肠道菌群结构和正常人相比会发生明显变化。如糖尿病患者肠道中产丁酸盐菌群减少，而潜在致病菌增多。因此，通过监测肠道菌群的组成及其变化可以判断人体的健康状况，从而对某些可能的疾病提前采取预防措施，促进人类健康。

肠道菌群检测涉及一些列实验操作，其中最基础最首要的步骤是用户粪便样本获取。自粪便DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种粪便DNA预处理方法，如Deuter et al.(1995)先将粪便于 -80℃冷冻，再匀浆，经两次差速离心除去了残渣，但经过柱洗脱才得到了纯度高的DNA；Lantz et al.(1997)利用聚乙二醇和葡聚糖40组成的二相系统对粪便进行预处理，也理想地除去了PCR抑制物，但花费较高，缺乏通用性；Machiels et al.(2000)用磷酸缓冲盐溶液和酚-氯仿-异戊醇组成的二相系统对粪便预处理，但其后的处理过程十分繁琐。此外研究者通常忽略了对样本的采集与保存步骤，实际应用中主要存在问题：

1、对粪便样本的保存条件要求严格，限制了肠道菌群检测的推广使用；

2、对样本的采样量缺乏过多的讨论，在用户采样量不确定的情况下，对实验结果的影响难以估计；

3、缺乏对粪便样本有效的预处理方案。由于粪便样本会包含多种类型的杂质，某些杂质的存在将会对后续DNA提取和PCR实验产生干扰，从而对实验结果造成较大的误差。上面PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。

粪便样本的采集与保存是肠道菌群检测的基础步奏，样本的质量直接影响检测结果的准确性和可靠性，过去的研究主要集中于实验室探究，较少面向公众；随着菌群检测的推广普及，越来越多的人开始使用此项服务。由于用户采样具有随机性和不确定性，如采样量和采样环境温度等都不易于控制，在此情况下，需要提出一种适用性广、安全可靠的采集和保存方法来满足大众的需求。

名词痕量样本：少得只有一点儿痕迹；在应用科学领域，指某种物质的含量在百万分之一以下称为痕量。痕量也可运用于化学、材料科学、生物医学等。

技术实现要素：

本发明针对目前人痕量粪便样本采集和保存的上述不足，提供一种采集和保存人痕量粪便样本的方法，该方法是一种通用性好、可靠性高、适用范围广的人粪便样本获取方法。

本发明实现其技术目的技术方案是：一种采集和保存人痕量粪便样本的方法，包括以下步骤：

步骤1、使用无菌器具采集人痕量粪便样本；

步骤2、将采集到的人痕量粪便样本溶解到缓冲液中；

步骤3、密封保存溶解有人痕量粪便样本到缓冲液，保存环境的温度范围为-15℃-65℃。

利用本发明的方法在确保得到高质量、高可靠的DNA前提下，最大化增加采样的便携性、通用性。

进一步的，上述的采集和保存人痕量粪便样本的方法中：所述的步骤1 中，用无菌棉签擦拭粪便样本，20mg-400mg粪便样本沾在无菌棉签即可。

进一步的，上述的采集和保存人痕量粪便样本的方法中：所述的步骤2 中，将沾有20mg-400mg粪便样本的无菌棉签插入装有缓冲液的采样管，轻轻晃动棉签1-5分钟。

进一步的，上述的采集和保存人痕量粪便样本的方法中：所述的步骤3 中，将采样管拧紧管盖后放入采样袋即可。

进一步的，上述的采集和保存人痕量粪便样本的方法中：所述的采样管为无锡耐思生物科技有限公司的NEST采样管。

进一步的，上述的采集和保存人痕量粪便样本的方法中：所述的缓冲液为国药集团化学试剂有限公司的PBS缓冲液。

以下将结合实施例，对本发明进行较为详细的说明。

具体实施方式

本实施例是一种采集和保存人痕量粪便样本的方法，本实施例中痕量样本也就少得只有一点儿痕迹的样本；在应用科学领域，指某种物质的含量在百万分之一以下称为痕量。痕量也可运用于化学、材料科学、生物医学等。其实质是用户用无菌棉签擦拭粪便样本，沾上20mg-400mg即可；随后将无菌棉签插入装有缓冲液的采样管中，轻轻晃动棉签1至5分钟，使样本溶于采样管，在室温下保存运输，确保实验室获得高质量的粪便样本。本实施例中，采样管中的缓冲液的量是1mL左右较合适,采样管的容积2-2.5mL合适。

本实施例的采集和保存方法(提取方法)包括粪便采集、保存和预处理三个方面的注意事项。

首先，用户使用存放有缓冲液的采样管附带无菌棉签擦拭新鲜粪便，将无菌棉签插入采样管，轻轻晃动棉签，使粪便样本溶于采样管中的缓存液，实践上，轻轻晃动棉签10s-20s即可，实验证明，无菌棉签插上的样本(新鲜粪便)在缓冲液中晃动15s左右就全部溶于缓冲液中了。随后拧紧采样管管盖，室温保存和运输即可，生活中室温在-10℃-40℃之间都可以。本实施例中，采样管中的缓冲液的量是1mL左右较合适,采样管的容积2-2.5mL合适。

采集是指用户用无菌棉签蘸取任意量的粪便样本20mg～400mg，突破了以往采样量往往规定在200mg的限制，因客户采样量大小具有较大的随机性。这里，本实施例提供一个宽泛的采样范围可以避免因采样量多少而对实验结果造成的相对误差。其次是保存，保存是指用户采样完毕后，将采样管拧紧管盖后放入采样袋，室温保存即可，而无需低温或者超低温保存，大大拓展了采样的适用条件；最后，在使用时还需要预提取，预提取就是一种在细胞裂解前经丙酮预处理的抽提方法。即先加入适量TE(TE缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution))溶解粪便样本，然后离心分离上清液，再次离心沉淀细胞，随后加入遇冷丙酮溶液洗涤沉淀细胞，重复洗涤操作几次，倾去丙酮，即可除去杂质。丙酮是一种优良的有机溶剂,在DNA的提取过程中曾被用来消除抑制物,有很好的效果

对样品进行预处理旨在除去样品中残存的保存液及其中的杂质。因此对取自非保存液保存的样品则无需进行预处理。

本实施例中，采样后通过改进型CTAB(CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide)主要用于提取生物 DNA)法提取的产物DNA纯度大于1.7(OD260/OD280)，DNA产物片断大于10Kb, 可进行基因扩增和测序。本方法对保存3年以内的样品均有效。如表1和表2 所示。

表1

表1中，紫外分光光度计测定不同保存采样量和保存温度条件的样本在开放试验台提取DNA产物的OD值。

表2中，紫外分光光度计测定不同保存采样量和保存温度条件的样本在无菌操作台提取DNA产物的OD值(OD值即OD260/OD280比值，指260nm和280nm 下吸光光度比值,OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度，纯DNA比值为1.8)。

表2

本实施例有较好的通用性，广泛适用于各种条件下人类粪便中肠道菌群 DNA采集与保存，使用范围广范，一般仅通过一次采样提取即可获取高质量的 DNA样本，在对16S rRNA基因的扩增中，所有提取的粪便DNA模板均能成功进行扩增。得到与预期大小相同的250bp产物，且浓度高、特异性强，测序结果证实了提取的真实性。

本实施例提供的人痕量样本的保存及提取方法，其方法如下所述：

一、粪便样本的采集：

(1)标记采样管；采样管的容积在2－2.5mL即可。

(2)在采样管中加入1mL缓冲液；

(3)用无菌棉签擦拭新鲜粪便，20－400mg都可以，并放入采样管轻轻摇晃15秒，使粪便样本溶入缓冲液；

(4)、拧紧采样管管盖，存放入采样袋。

二、粪便样本的保存及运输：

采样袋中放入放入医用级干燥剂，确保采样袋内干燥并抑制细菌生长。采样管装入采样袋后密封采样袋，室温保存运输即可。

三、实验准备：

准备好量程分别为1ml、1.5ml、50ml的微量移液器；水浴锅温度至55 ℃；高速离心机离心力要能达到10 000g；确保1.5ml和2m1离心管均己灭菌：确保所有溶液无沉淀、无结晶，若有沉淀或结晶，可用70℃水浴让其溶解；将无水乙醇置于-20℃冷冻，将TE加热到65℃以利于DNA的溶解或洗脱，将丙酮置于4℃冷藏。

四、样本预提取：

粪便样本运输到待检测实验室后进行预提取工作，不同条件下收到的样本预处理可能略有点不同，如冬季运输到实验室的样本可能会因为温度过低样本与缓冲液凝结在一起，因此预处理时必须首先对他们经行加热处理，即冻存样本于55℃水浴加热5分钟以使其溶解。随后将样本倒管入2ml Ep管， 10,000rmp离心3min，然后再用磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品，以除去残存的保存液。这是由于粪便样本内的肠道菌群会溶解于磷酸缓冲液(PBS)或0.9％的生理盐水，粪便里面的固态杂质不溶于PBS或 0.9％的生理盐水，且需要通过洗涤除掉它们。

实践操作：

1、北京王先生冬天(室外-5℃)取样300mg样本寄送到武汉某实验室做肠道菌群检测

王先生早上如厕后用新拆开无菌棉签擦拭粪便约300mg，随后将棉签放入预先装有缓冲液的采样管，轻轻摇晃棉签，使棉签上的粪便样本溶入采样管内的缓存液，随后取出棉签，拧紧采样管管盖，将采样管放入采样袋，封闭采样袋。然后将采样袋装入文件夹，通过顺丰寄送给武汉某实验室进行检测。

由于室温较低，实验人员收到采样袋后打开发现采样管内液体已凝固，于是打开恒温水浴锅，调整其温度至55℃。将采样管放入水浴锅(55℃)水浴5min，待其完全解冻后将其取出。将采样管中的样本溶液转移至无菌2ml Ep 管(eppendorf管，就是离心管的意思)，于10,000rpm离心3min，然后再用0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品，重复此操作三次，以除去残存的保存液。随后即可进行粪便样本菌群DNA提取操作。

2、泉州刘女士夏天(室外35℃)取样100mg样本寄送到武汉某实验室做肠道菌群检测

刘女士下午如厕后用采样袋附带无菌棉签擦拭粪便约100mg，随后将棉签放入预先装有缓冲液的采样管，轻轻摇晃棉签，使棉签上的粪便样本溶入采样管内的缓存液，随后取出棉签，拧紧采样管管盖，将采样管放入采样袋，封闭采样袋。然后再将采样袋装入文件夹，通过顺丰寄送给武汉某实验室进行检测。

由于夏天室温不低，实验人员收到采样袋后打开发现采样管内液体没变，将其取出。将采样管中的样本溶液转移至无菌2ml Ep管，于10，000rpm离心3min，然后再用0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品，重复此操作三次，以除去残存的保存液。随后即可进行粪便样本菌群DNA提取操作。

上述方法中所用的试剂及设备如下所述：

(一)试剂耗材：

PBS缓冲液；国药集团化学试剂有限公司；

生理盐水：国药集团化学试剂有限公司；

醋酸钠：国药集团化学试剂有限公司；

采样管：NEST Biotechnology；

1.5ml、2.0ml无菌离心管：NEST Biotechnology；

移液枪：Eppendorf Company

(二)设备

电热恒温水槽：型号-DK-S420，上海申贤恒温设备厂

台式高速离心机：型号-D3024，SCILOGEX Company

微型旋涡混合仪：型号-XW-80A，上海沪西分析仪器厂。