本发明涉及生物领域，特别是涉及转录组的数据获得和分析技术，更具体的说，是涉及一种基于逆转录-全外显子捕获技术(rt-wes)的转录组测序方法。
背景技术：
转录组是在某一特定发育时期或某一生理条件下，一个活细胞所能转录出来的所有rna的总和。转录组分析是研究细胞表型和功能的一个重要手段。目前常规的转录组分析方法主要有基于杂交技术的生物芯片(包括cdna芯片和寡聚核苷酸芯片)技术和基于序列分析的rna测序技术。其中：生物芯片技术是半定量杂交分析技术，只能分析不同基因转录本表达高低，无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，而且由于芯片技术需要准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、表达丰度不高的、但可能很重要的调节基因，因此已无法满足现代肿瘤学研究的需求。rna测序技术(rna-seq)的优点是：可以定量分析转录本表达量的变化；在肿瘤学研究中，可以通过rna突变获得突变基因表达的信息，并有效准确地获得融合基因是否存在的信息。缺点是：对样本rna的质量和起始量要求高(要求rna完整性rin>7，起始量>2μg)，需要使用新鲜组织来源的rna。由于新鲜组织保存困难，临床经常没有新鲜组织样本，只有石蜡切片，而从石蜡切片中获得的rna，其rin值，好的小于3，差的根本无法评估，因此，对于临床样本，特别是石蜡切片白片来源的rna，采用传统rna-seq技术无法直接建库并获得有效数据，即使使用更多的数据量来进行分析，效果仍然不佳，而成本却会提高很多。外显子组(exome)，即一个个体的基因组dna上所有蛋白质编码序列(外显子)的总和。全外显子捕获技术，目前常规只用于基因组dna的外显子部分的捕获富集。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种基于rt-wes的转录组测序方法，它可以降低对样本rna的质量和起始量的要求，并可以提高转录组测序数据的信噪比。为解决上述技术问题，本发明的基于rt-wes的转录组测序方法，包括以下步骤：1)提取样本总rna；2)以所述总rna为模板，合成cdna；3)构建cdna片段化文库；4)对所述片段化文库进行全外显子捕获，富集功能基因的转录组片段；5)对所述转录组片段进行测序并分析测序数据。上述步骤1),所述样本可以是rna质量较差、总量较低的临床样本，例如用福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)的组织样本。上述步骤2)可以进一步包括以下步骤：21)以所述总rna为模板，在逆转录酶的作用下，合成cdna的第一链；22)以所述第一链为模板，在dna聚合酶的作用下，合成cdna的第二链。其中，步骤21)，逆转录反应体系优选为包括以下组分：100-500ng总rna13.5μl，50ng/μl随机引物1μl，5x第一链合成反应缓冲液4μl，rnase抑制剂0.5μl，200u/μl逆转录酶1μl，总体积20μl。逆转录反应条件优选为：25℃10分钟；42℃50分钟；70℃15分钟；4℃保持。步骤22)，合成反应体系优选为包括以下组分：第一链产物20μl，第二链合成反应缓冲液8μl，rnaseh1μl，10u/μldna聚合酶2μl，10u/μldna连接酶1μl，无核酸酶水48μl，总体积80μl。在cdna的第二链合成完成后，还可以进一步包括纯化、干燥、定量、cdna片段评估等常规操作步骤。本发明采用逆转录-全外显子组测序(reversetranscriptwholeexomesequencing，rt-wes)技术，将从ffpe样品提取获得的总rna，先经反转录获得第一链产物，再通过第二链合成，获得互补dna(即cdna，这种cdna是混杂了rrna、hnrna、mirna、lncrna的高背景混合物，且片段短)，然后通过全外显子捕获技术，富集功能基因外显子区域，去掉其他不需要的背景，经二代测序获得rrna和基因组dna干扰少、功能基因表达富集高、背景低的转录组测序数据，实现从劣质的石蜡样本rna中获得肿瘤基因表达信息、剪切信息和融合信息等信息的目的。与现有的转录组获得和分析技术相比，本发明的rt-wes技术具有以下优点和有益效果：1)降低了对样本rna的质量和起始量的要求。本发明对样本rna的质量和起始量的要求低，起始量只要>300ng，适用于临床样本，特别是石蜡切片来源的降解rna。2)没有去除rrna的步骤。本发明无需使用ribozero等技术去除rrna，减少了降解rna处理过程中的进一步损失。3)采用全外显子捕获富集，在相同数据量下，相比传统的rna-seq方法，可以获得更多的转录组数据，信噪比更高。4)在肿瘤学中，可以为突变基因转录本表达变化分析，提供更为精准高效的途径，包括点突变基因的表达、融合基因的检出及表达、扩增基因的表达等，从而为分子病理分型提供更为可靠的依据。5)结合基因组dna全外显子测序数据，可以非常有效的进行肿瘤驱动基因分析，为肿瘤新抗原预测提供数据。附图说明图1是本发明实施例的rt-wes技术流程图。图2是本发明实施例ffpe来源的总rna经反转录获得的cdna图。图3是本发明实施例的rt-wes方法和传统rna-seq方法的转录本覆盖比较。其中，(a)图为用新鲜组织来源rna并用标准rna-seq方法建库得到的转录本的基因覆盖度分析结果；(b)图为用本发明实施例的ffpe样本rna并用rt-wes方法建库得到的转录本的基因覆盖度分析结果。图4是本发明实施例的rt-wes方法和传统rna-seq方法的测序读长比较。其中，(a)图为用新鲜组织来源rna并用标准rna-seq方法建库得到的转录本的测序读长分析结果；(b)图为用本发明实施例的ffpe样本rna并用rt-wes方法建库得到的转录本的测序读长分析结果。图5是本发明实施例的rt-wes方法和传统rna-seq方法的可变剪切比较。其中，(a)图为用新鲜组织来源rna并用标准rna-seq方法建库得到的转录本的基因可变剪切分析结果。(b)图为用本发明实施例的ffpe样本rna并用rt-wes方法建库得到的转录本的基因可变剪切分析结果。具体实施方式为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一、提取样本总rna使用thermofisher公司生产的magmaxtmffpedna/rnaultrakit(货号a31881)试剂盒，按照试剂盒说明书的记载，从福尔马林固定和石蜡包埋(formalin-fixedandparrffin-embedded，ffpe)的组织样本中提取rna，获得ffpe样本总rna。二、合成cdna1.第一链合成1)取一个无核酸酶污染的0.2mlpcr反应管，加入表1所列成分(其中，随机引物包含有6个碱基)，吸打混匀。本步骤需要在去核酸酶污染的安全柜中进行操作，并保证所用水是无核酸酶污染的。表1成分体积(μl)ffpe样本总rna(100-500ng)13.5随机引物(50ng/μl)12)将上述pcr反应管放置在pcr仪上，在65℃下孵育5分钟，结束后迅速转移至冰盒上，并在该pcr反应管中加入表2所示成分，吸打混匀。表23)将上述pcr反应管放置在pcr仪上，在25℃下孵育2分钟。然后在该pcr反应管中加入1μliireversetranscriptase(逆转录酶，200u/μl)，轻轻吸打混匀。在pcr仪上设定逆转录反应程序，进行逆转录反应。逆转录反应体系总体积为20μl，反应条件如表3所示。表3逆转录反应条件2.第二链合成1)第一链合成完成后，将产物pcr管置于冰盒上，并在该pcr管中加入表4所示成分，吸打混匀(不可振荡混匀)。表42)将上述pcr管放置在pcr仪上，在16℃下孵育1小时，不要盖上热盖。3)步骤2)的反应结束后，将产物转入1.5ml离心管，加入144μl纯化磁珠(全式金ec401magicpuresizeselectiondnabeads)，振荡混匀，短暂离心收集至管底，室温静置5分钟后，将该离心管转移到磁架上，静置2分钟或直至溶液澄清。小心吸去上清，弃掉。4)在上述离心管中加入500μl新鲜配置的80％乙醇，静置30秒后，吸掉上清。重复本步骤一次。5)从磁架上取下上述离心管，短暂离心后，放回磁架，吸去残余液体，开着管盖在室温下干燥5分钟(不要超过5分钟，以避免过度干燥)后，加入60μl无核酸酶水，从磁架上取下该离心管，旋涡振荡5s，短暂离心收集溶液至管底，放回磁架，静置2分钟或直至溶液澄清。将上清转移至新的离心管中，用qubiths定量，cdna总量须大于50ng。6)使用agilent4200的highsensitivityd5000kit进行cdna片段评估。结果如图2所示，片段弥散分布在100-600bp范围内。二、低起始量文库构建和全外显子捕获使用kapahyperpluslibrarypreparationkit(货号kr1145)，按照说明书记载的操作方法，构建cdna片段化文库。主要操作步骤包括：末端修复和a-tailing反应，测序接头连接，pcr扩增，纯化获得片段化文库。具体请参见说明书的记载。其中，在构建cdna片段化文库前，上述合成的第二链产物无需片段化。使用agilentsureselectxt2reagentkit和idtxgenexomeresearchpanelv1.0，按照说明书记载的操作方法，对上述片段化文库进行全外显子捕获，富集功能基因的转录组片段。主要操作步骤包括：文库封闭及探针杂交；富集捕获片段，洗去未结合的文库片段和多余探针；捕获文库扩增；纯化质检，获得合格的用于高通量测序的文库。具体请参见说明书的记载。在其他实施例中，也可以使用agilent的sureselectxtlowinputreagent或sureselectxthsreagent，无需另外建库，这两个试剂都可以适用于低起始量文库构建和外显子捕获的全过程。三、测序采用illumina的nextseq500测序系统进行高通量测序，获得测序数据。在其他实施例中，也可以采用illumina的hiseq2000/2500/3000/4000、hiseqxten或novoseq等测序系统。四、数据结果分析将上述使用ffpe样本rna并通过rt-wes方法建库测序获得的数据，与常规的使用新鲜组织来源rna(rin值至少大于5)并使用标准的rna-seq方法建库测序获得的数据进行比较。1.转录本覆盖比较比较结果如图3所示，(a)图为采用标准的rna-seq建库测序方法得到的转录本数据，在5’端和3’端基因覆盖非常均匀。(b)图为采用本发明实施例的rt-wes方法得到的转录本数据。本发明实施例的ffpe样本来源的rna，由于在ffpe制作的过程中存在降解，基因的覆盖度不如(a)图，但60％的基因区域可以覆盖到65％以上，对于表达量的评估已经非常准确。2.测序读长比较结果如图4所示，(a)图为标准的rna-seq建库测序方法的测序读长，(b)图为本发明实施例的rt-wes方法的测序读长。两种方法测序获得的插入inner_distance都为100左右，也就是rna都降解到100bp左右，无显著差异。由于临床样本普遍保存条件差，本发明实施例使用的ffpe样本rna的质量(rin值低于3)要远远差于标准rna-seq方法使用的新鲜组织来源rna的质量(rin值至少大于5)，而两种方法测序读长无明显差异，可见本发明的rt-wes方法相比标准rna-seq方法的优异性。3.可变剪切比较结果如图5所示，(a)图显示了采用标准的rna-seq建库测序方法得到的转录组，其外显子基因发生可变剪切的比例；(b)图显示了采用本发明实施例的rt-wes方法得到的转录组，其外显子基因发生可变剪切的比例。从数据上看splicing位点分析，新鲜组织来源rna只有61％的外显子基因发生了可变剪切，而本实施例的ffpe样本rna有69％的外显子基因发生了可变剪切，可见本实施例的rt-wes方法优于常规rna-seq方法。由以上对比可以看到，本发明实施例使用石蜡切片来源的rna，并用rt-wes方法建库，在rna质量和总量远低于新鲜组织来源rna的质量和总量的情况下，不仅直接建库成功，获得了有效的转录组数据，而且所获得的转录组数据与使用新鲜组织来源rna并用标准rna-seq方法建库得到的转录组数据结果接近甚至更好，充分体现了本发明的rt-wes方法相比传统rna-seq方法的优异性。当前第1页12