基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

沙门氏菌是肠杆菌科中一大类重要的食源性致病菌，沙门氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位。who食源性疾病监控计划显示，欧洲每年约有160000人感染沙门氏菌。每年用于沙门氏菌的防控和治疗费用高达28亿欧元。在某些国家，70％～80％细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起，引起沙门氏菌中毒食品中，约有90％是肉、蛋、奶等畜牧产品。沙门氏菌感染畜禽后可引发一系列疾病，在动物屠宰过程中，肠道中的致病菌会污染屠宰环境或被带到内脏与体表，成为畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源。卫生检测要求中，世界各国普遍规定食品不得检出沙门氏菌。

目前，沙门氏菌传统的检测方法大多采用细菌分离，生化鉴定表型方法、基于抗体的免疫学方法等，在快速，敏感与特异性等方面具有局限性。pcr法需要昂贵的循环仪，不适于基层快速检测。而目前应用最广泛的恒温扩增技术-lamp也有它的局限性，如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性强。聚合酶螺旋反应(polyme-rasespiralreaction，psr)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对沙门氏菌新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物。

本发明的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物，包括检测引物ft、bt，以及加速引物if、ib，其核苷酸序列如下所示(5’-3’)：

检测引物ft:cacaaagatgataatgatgcctactggaaagggaaagcc(seqidno.1)；

检测引物bt：ccgtagtaatagtagaaacacgacagagcggaggataaa(seqidno.2)；

加速引物if:tcatcgcaccgtcaaa(seqidno.3)；

加速引物ib:tggcggtatttcggtggg(seqidno.4)。

一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，包括上述基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物。

所述的聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物中的各引物(检测引物ft、bt，以及加速引物if、ib)的浓度均为50μm。

所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的试剂盒，还包括如下组分：

a、2×反应储液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；

b、bstdna聚合酶；

c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。

组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；

(ii)取15μl50μm的钙黄绿素溶液与9μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:12)。

一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.8～2.0；

(2)于65℃水浴中保温40～45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应储液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，50μm的加速引物if和50μm的加速引物ib各0.4μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，加水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；

(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化：如颜色为黄色，说明待检样品中不含有沙门氏菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有沙门氏菌。

步骤(2)中所述的检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示，加速引物if的核苷酸序列如seqidno.3所示，加速引物ib的核苷酸序列如seqidno.4所示。

步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；

(ii)取15μl50μm的钙黄绿素溶液与9μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供基于聚合酶螺旋反应检测沙门氏菌的试剂盒，其具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位及现场检测应用的特点。

(2)本发明中所提供的针对沙门氏菌特异性靶序列inva所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。

(3)本发明与现有技术相比具有以下优点：可以将检测时间减少到40～45分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对沙门氏菌的特异性靶序列inva(genebankaccessionno.dq644631.1)保守区的特异区域设计了一对检测引物和一对加速引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在45分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果。

附图说明

图1为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的结果及凝胶电泳结果图；其中，图a为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的结果(ng为空白对照，1为沙门氏菌atcc14028，2为沙门氏菌atcc29629)；图b为聚合酶螺旋反应技术检测沙门氏菌的凝胶电泳结果(泳道ng为空白对照；泳道1为沙门氏菌atcc14028，泳道2为沙门氏菌atcc29629)。

图2为特异性检测实验结果的照片图及凝胶电泳结果图；其中，图a为特异性检测实验结果(1：沙门氏菌atcc14028；2：沙门氏菌atcc29629；3：大肠杆菌atcc43895；4：大肠杆菌atcc438944：5：铜绿假单胞菌atcc27853；6：单增李斯特菌atcc19116；7：单增李斯特菌atcc19114；8：金黄色葡萄球菌atcc27664；9：干酪乳杆菌gbhm-21；10：阴性对照)；图b为凝胶电泳结果(泳道m：dnamarker；泳道1：沙门氏菌atcc14028；泳道2：沙门氏菌atcc29629；泳道3：大肠杆菌atcc43895；泳道4：大肠杆菌atcc438944：泳道5：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道6：单增李斯特菌atcc19116；泳道7：单增李斯特菌atcc19114；泳道8：金黄色葡萄球菌atcc27664；泳道9：干酪乳杆菌gbhm-21；泳道10：阴性对照)。

图3为敏感性实验结果照片图及凝胶电泳结果图；其中，图a为敏感性实验结果(1：12.3ng/μl；2：1.23ng/μl；3：123pg/μl；4：12.3pg/μl；5：1.23pg/μl；6:阴性对照)；图b为凝胶电泳结果(泳道m：dnamarker；泳道1：12.3ng/μl；泳道2：1.23ng/μl；泳道3：123pg/μl；泳道4：12.3pg/μl；泳道5：1.23pg/μl；泳道6:阴性对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测沙门氏菌的微生物方法

1、基于聚合酶螺旋等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以沙门氏菌为例，其使用试剂如下：

a.浓度各为50μm的检测引物ft水溶液和bt水溶液，加速引物if及ib水溶液，引物序列如下(5’-3’)：

检测引物ft:cacaaagatgataatgatgcctactggaaagggaaagcc(seqidno.1)；

检测引物bt：ccgtagtaatagtagaaacacgacagagcggaggataaa(seqidno.2)；

加速引物if:tcatcgcaccgtcaaa(seqidno.3)；

加速引物ib:tggcggtatttcggtggg(seqidno.4)；

b.2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，硫酸铵20.0mm，氯化钾20.0mm，硫酸镁16.0mm，0.2％(v/v)tween20，甜菜碱1.4m，dntps(each)10.0mm的混合液组成

c.浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；

d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配置浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取15μl50μm的钙黄绿素溶液，与9μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:12)。

2、使用上述试剂利用聚合酶螺旋反应扩增技术检测沙门氏菌，包括如下步骤:

(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为2株沙门氏菌(atcc14028，atcc29629)；采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。

(2)沙门氏菌的聚合酶螺旋扩增反应：

在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系：加入2×反应储液12.5μl，ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，加速引物if与ib等体积混合液0.8μl,bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，引物ft、bt各1.6μm,引物if、ib各0.8μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应45分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。

(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化

结果如图1所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有沙门氏菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有沙门氏菌，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。

实施例2聚合酶螺旋反应检沙门氏菌的特异性试验

将沙门氏菌与非沙门氏菌的基因组dna按照上述反应体系和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验，其中非沙门氏菌为：沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc29629，大肠杆菌atcc43895，大肠杆菌atcc438944，铜绿假单胞菌atcc27853，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，金黄色葡萄球菌atcc27664，干酪乳杆菌gbhm-21(鲍志宁.干酪乳杆菌gbhm-21鉴定、中试制备及发酵技术研究[d].华南理工大学,2015.)。设置沙门氏菌基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照，结果如图2所示。结果表明，只有沙门氏菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。

实施例3psr检测沙门氏的敏感性试验

将沙门氏菌的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为12.3ng/μl，1.23ng/μl，123pg/μl，12.3pg/μl和1.23pg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照实施例1中的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的敏感性，结果如图3所示。结果表明：建立的沙门氏菌聚合酶螺旋反应方法可检测样品中123pg/μl反应的沙门氏菌dna。

结论：从上述实验结果可以看出，基于聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：

操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法在40分钟左右就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。

特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>基于聚合酶螺旋反应恒温检测沙门氏菌的引物、试剂盒及检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>检测引物ft

<400>1

cacaaagatgataatgatgcctactggaaagggaaagcc39

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccgtagtaatagtagaaacacgacagagcggaggataaa39

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>加速引物if

<400>3

tcatcgcaccgtcaaa16

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>加速引物ib

<400>4

tggcggtatttcggtggg18