本发明属于生物技术领域，特别涉及一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法。
背景技术
志贺毒素主要是由大肠杆菌产生的，产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingescheriachiacoli，stec)—是食品主要致病菌之一。stec主要毒力因子位于噬菌体上的stx1、stx2基因上，这两种基因分别编码志贺毒素stx1、stx2。志贺毒素stx1、stx2导致病人感染的剂量很低，可导致病人剧烈腹痛和腹泻，严重者发生急性肾衰竭而死亡。
目前对志贺毒素的检测方法主要有传统的生化鉴定方法，以及分子生物技术的pcr方法，还有以免疫学为主的酶联免疫试剂盒和应用各类生化自动鉴定仪的检测方法，以及最新出现的基因芯片检测手段。常规检测鉴定方法工作量相对较大且检测结果一般4～5天才能得出结果，耗时长，根据实验现象判断鉴定结果，很难满足快速鉴定的需要。近年来发展起来的基因芯片检测及pcr扩增方法具有较强的特异性、快速、灵敏，但是成本较高。免疫学检测方法，如elisa，免疫层析等，灵敏度高，但是操作过程复杂，成本偏高，不宜于大规模检测样品。目前应用最广泛的恒温扩增技术-lamp也有它的局限性，如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高，且由于日本知识产权的保护，我国在转化应用上局限性强。聚合酶螺旋反应(polymerasespiralreaction,psr)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对大肠杆菌志贺毒素新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物。
本发明的另一目的在于提供一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的方法。其具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物，包括检测引物ft和检测引物bt，其核苷酸序列如下所示：
检测引物ft:
5’-ctcttcagccagtcgtcgtgcaacagcgacatcatccg-3’(seqidno.1)；
检测引物bt：
5’-gtgctgctgaccgacttctcattccttcccgtaacaact-3’(seqidno.2)。
一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒，包括上述psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物。
所述的psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物中检测引物ft和检测引物bt的浓度均为50μm。
所述的psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒，还包括如下组分：
a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；
b、bstdna聚合酶；
c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。
组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；
(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
所述的psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的试剂盒在检测大肠杆菌志贺毒素中的应用。
一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.8～2.0；
(2)于65℃水浴中保温40～45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌志贺毒素；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌志贺毒素。
步骤(2)中所述的检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示。
步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；
(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中所提供的针对志贺毒素异性靶序列stx2所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。
(2)本发明的方法可以将检测时间减少到60分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对志贺毒素的特异性靶序列stx2(genebankaccessionno.af162758.1)保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在60分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。
附图说明
图1为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的结果及凝胶电泳结果图；其中，图a为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的结果(ng为空白对照；1为大肠杆菌o157:h7atcc43895，2为大肠杆菌e019，3为大肠杆菌e020，4为大肠杆菌e043，5为大肠杆菌e044)；图b为聚合酶螺旋反应技术检测志贺毒素的凝胶电泳结果(泳道ng为空白对照；泳道1为大肠杆菌o157:h7atcc43895，泳道2为大肠杆菌e019，泳道3为大肠杆菌e020，泳道4为大肠杆菌e043，泳道5为大肠杆菌e044)。
图2为特异性检测实验结果图；其中，1：大肠杆菌e019；2：大肠杆菌e020；3:大肠杆菌e043；4:大肠杆菌e044；5：大肠杆菌atcc43895；6：沙门氏菌atcc29629；7：沙门氏菌atcc19585；8：沙门氏菌atcc14028；9：沙门氏菌atcc13076；10:单增李斯特菌atcc19116；11：单增李斯特菌atcc19114，12：单增李斯特菌atcc19115；13：铜绿假单胞菌atcc27853；14：铜绿假单胞菌atcc9027；15：金黄色葡萄球菌atcc23235；16：金黄色葡萄球菌atcc6358；17：副溶血性弧菌atcc17802。
图3为敏感性实验结果图；其中，20为68ng/μl，21为6.8ng/μl，22为680pg/μl,23为68pg/μl，24为6.8pg/μl，25为680fg/μl，26为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测e.colio157:h7的微生物方法
1、基于聚合酶螺旋等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以e.colio157:h7为例，其使用试剂如下：
a.浓度各为50μm的检测引物ft水溶液和bt水溶液引物序列如下(5’-3’)：
检测引物ft:ctcttcagccagtcgtcgtg-caacagcgacatcatccg(seqidno.1)；
检测引物bt：gtgctgctgaccgacttctc-attccttcccgtaacaact(seqidno.2)；
b.2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，硫酸铵20.0mm，氯化钾20.0mm，硫酸镁16.0mm，0.2％(v/v)tween20，甜菜碱1.4m，dntps(each)10.0mm的混合液组成；
c.浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；
d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配置浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl50μm的钙黄绿素溶液，与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
2、使用上述试剂利用聚合酶螺旋反应扩增技术检测志贺毒素，包括如下步骤:
(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：
本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为五株大肠杆菌o157:h7atcc43895(美国菌种保藏中心)，e019[1]，e020[1]，e043[1]，e044[1]；采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
(2)大肠杆菌志贺毒素的聚合酶螺旋扩增反应：在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，引物ft、bt各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化
结果如图1所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明检测菌株不含有志贺毒素基因；实验组的颜色变为绿色，说明含有志贺毒素基因，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
实施例2聚合酶螺旋反应检测志贺毒素特异性试验
将含有志贺毒素的大肠杆菌(大肠杆菌e019[1]，大肠杆菌e020[1]，大肠杆菌e043[1]，大肠杆菌e044[1]，大肠杆菌atcc43895)与不含有志贺毒素其他菌株(沙门氏菌atcc29629，沙门氏菌atcc19585，沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc13076，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特菌atcc19115，铜绿假单胞菌atcc27853，铜绿假单胞菌atcc9027，金黄色葡萄球菌atcc23235，金黄色葡萄球菌atcc6358，副溶血性弧菌atcc17802的基因组dna按照上述反应体系和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验。设置含有志贺毒素大肠杆菌的基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照(阴性对照与图1中的空白对照的结果相同)，结果如图2所示。结果表明，只有含有志贺毒素大肠杆菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。
实施例3psr检测大肠杆菌志贺毒素的敏感性试验
将大肠杆菌o157的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为68ng/μl，6.8ng/μl，680pg/μl，68pg/μl，6.8pg/μl，680fg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例1中的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的敏感性，结果如图3所示。结果表明：建立的大肠杆菌志贺毒素聚合酶螺旋反应方法可检测样品中680pg/μl的大肠杆菌dna。
结论：从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：
操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。
特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。参考文献
[1]周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015。
序列表
<110>华南理工大学
<120>一种psr等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>检测引物ft
<400>1
ctcttcagccagtcgtcgtgcaacagcgacatcatccg38
<210>2
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>检测引物bt
<400>2
gtgctgctgaccgacttctcattccttcccgtaacaact39