本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。
背景技术：
micrrna可以通过使mrna翻译受阻或者过表达来参与基因转录后水平调控，最终导致靶蛋白低水平异常，从而影响细胞发育、分化、生长、凋亡和新陈代谢等生理及病理过程。而关于micrrna的研究已发现，micrrna的异常表达与调控机制和糖尿病视网膜病变的发病之间存在着紧密联系。micrrna作为一种新型基因表达调控因子，其表达谱犹如网络结构纷繁复杂，虽然不少研究者已经在micrrna与糖尿病视网膜病变领域的研究中取得一些进展，但仍然处于起步阶段，需要更深入广泛的研究来阐明两者之间的确切关系，随着被发现的micrrna越来越多，其与糖尿病视网膜病变之间的关系将被越阐越明，也更有利于我们找到属于糖尿病视网膜病变最具特异性的micrrna。糖尿病视网膜病变是导致糖尿病病人失明的主要因素；糖尿病视网膜病变与视网膜内皮细胞异常血管新生有密切关系；vegf是导致糖尿病视网膜病变发生和发展的重要病理因素；microrna亦是导致糖尿病视网膜病变的重要分子机制；针对vegf表达具有调控作用的microrna研究将对糖尿病视网膜病变的研究提供重要方向；探究糖尿病视网膜病患者外周循环血中microrna表达亦是对糖尿病视网膜病变发病机制提供重要基础数据。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。本发明采用micrrna为手段，能够早期预测诊断糖尿病视网膜病变，可以在糖尿病视网膜功能和形态改变之前就给予干预，及早预防和治疗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明提供micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂中的应用。同时，还提供micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂盒中的应用。进一步，优选的是，试剂包括采用基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测血浆中micro-15b转录水平的试剂。进一步，优选的是，所述的样本为外周血。进一步，优选的是，试剂包括采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法或原位杂交检测血浆中micro-15b的转录水平的试剂。进一步，优选的是，所述的样本为外周血。本发明还提供一种诊断糖尿病视网膜病变的试剂，包括药学上可接受的载体和有效量的micro-15b。本发明另外提供一种诊断糖尿病视网膜病变的试剂盒，包括micro-15b。本发明与现有技术相比，其有益效果为：目前对糖尿病视网膜病变做诊断的手段主要是通过形态学的方法如眼底照相、眼底血管造影等，这些诊断为时已晚，不具备早期预测、早期诊断的作用，可能失去病情最早的治疗时机，延误病情。本发明为了解决现有技术的这些不足，提供micro-15b在制备诊断糖尿病视网膜病变试剂、试剂盒中的应用。该试剂和试剂盒可用于早期预测、早期诊断糖尿病视网膜病变和判断糖尿病视网膜病变治疗效果；本发明采用micrrna为手段，能够早期预测诊断糖尿病视网膜病变，可以在糖尿病视网膜功能和形态改变之前就给予干预，及早预防和治疗，具有良好的应用前景。附图说明图1为糖尿病视网膜病变患者及正常人群外周血rna测序分析结果图；其中a为糖尿病视网膜病变患者3例，正常人群3例测序结果进行cluster分析结果；b为测序结果中差异microrna表达值取对数2结果(log2foldchange)、统计差异分析结果值(p-value)、与靶基因结合热力学稳定性评分(mirsvrscore)以及microrna在各物种中进化保守性评分(phastconsscroe)。图2为mir-15b与靶基因vegf体外结合检测结果图；其中a为vegf的野生型(wt)或突变型(mut)的3'-utr序列区中mir-15b结合序列信息；b为mir-15b作用于vegf的3’-utr区域后，相对荧光素酶活性检测(relatvieluciferaseactivity)结果，其中mir-15b处理组与nc(阴性对照)处理组相比较，**p<0.01；3’utr-vegf(wt)与3’utr-blank处理组相比较，##p<0.01；3’utr-vegf(wt)与3’utr-vegf(mut)相比较，@@p<0.01。3’utr-blank为空载体，3’utr-vegf(wt)为野生型vegf3'-utr区域，3’utr-vegf(mut)为突变型vegf3'-utr区域。图3为gk大鼠视网膜免疫组化和免疫荧光铺片图；其中a为gk大鼠眼底注射let-nc及let-mir-15b病毒后，原位杂交检测视网膜中mir-15b表达情况；b为gk大鼠眼底注射let-nc及let-mir-15b病毒后，视网膜铺片染色检测结果，可发现注射let-mir-15b后，gk大鼠视网膜中血管病变减少；let-nc为阴性对照病毒，let-mir-15b为mir-15b过表达病毒，外核层(onl)、内核层(inl)、浅层视网膜(ipl)和神经节细胞层(gcl)。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明除非另有说明，否则百分数表示质量百分数；比例为质量比。1患者本研究所涉及的患者为2014年1月到2016年1月在云南省第二人民医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病患者，共入组238名。所有患者均进行眼底检查(裂隙灯观察)，并记录眼底情况。而针对糖尿病视网膜病变患者还行眼底荧光造影检查。将所有糖尿病患者分为糖尿病无视网膜病变组(ndr)、非增殖性糖尿病视网膜病变组(npdr)和增殖性糖尿病视网膜病变组(pdr)。其中有风湿病和感染性疾病的患者被排除于本研究。血浆中vegf水平用酶联免疫法测定(invitrogen,carlsbad,ca,usa)。本研究经云南省第二人民医院伦理委员会同意，患者在参加本研究之前均已进行告知，并签署知情同意书。2循环血中差异microrna的测序分析选取ndr组和pdr组各3名患者，分别采用trizol试剂盒(invitrogen)提取总rna。rna提取质量使用bioanalyzer2200(aligent)分析仪检测，rna纯度测定值：rin>8.0时证明microrna纯度过关，microrna纯化采用mirneasyminikit(qiagen)试剂盒进行纯化，microrna纯化结果使用凝胶电泳验证。使用iontotalrna-seqkitv2.0(lifetechnologies)试剂盒来构建单链测序用cdna文库，操作步骤依据试剂盒说明书进行。通过page凝胶电泳分析cdna大小，依据microrna分子量大小，收集cdna文库中microrna片段并进行microrna测序。microrna的cdna文库依据通用步骤进行proton测序分析，microrna的cdna样品从凝胶中洗脱并与检测试剂盒中的反应缓冲液混匀后，使用ionpitmtemplateot2200kitv2.0(lifetechnologies)试剂盒，在onetouch2esstation(lifetechnologies)仪器中对microrna的cdna样品进行富集纯化。microrna的cdna样品纯化后，与template-positiveionpitmionspheretmparticles微粒进行混合(1:100)，之后将混合物上样于1p1v2protonchip(lifetechnologies)测序板，同时使用ionpisequencing200kitv2.0(lifetechnologies)试剂盒进行proton测序分析。针对测序结果，我们进行差异表达算法分析(deg-seq)循环血中具显著性差异性microrna并同时计算差异表达microrna的显著度(fdr)。差异microrna筛选标准为：1)差异倍数为>1.5或者<0.667；2)显著度(fdr)<0.01。而针对microrna与vegf靶向性关系分析，我们采用mirsvr及phastcons分析数值进行评估。mirsvr：热力学稳定性系数，分值越低则表明mirna-mrna二者结合稳定性越强，相应microrna下调该基因的可能性越大；phastcons：为基因非翻译区在各物种中进化保守性的强弱(大于等于0)，保守性越大约好。3.循环血中mir-15b检测循环血中的microrna分离如2中所述，用taqman实时定量pcr(appliedbiosystems,ca,usa)检测血浆中mir-15b丰度。每个样本测定均进行三次重复，数据呈现为三次平均值。依据taqmanmirna分析试剂盒，针对循环血中microrna使用逆转录试剂盒进行逆转，并通过pcr检测成熟microrna的表达。pcr反应体系为：micrornaassay(1μl)，universalmastermixii,noung(10μl)，无酶水(7μl)，cdna(2μl)，总体积(20μl)。反应程序为：95℃，10分钟；50℃，15秒；60℃，1分钟；共40个循环。同时，为了校正结果加入秀丽隐杆线虫的mirna(cel-mir-39)作为外参照，对检测结果进行校准。最终循环血中mir-15b丰度计算公式为：2-δ(ct[mir-15b]-ct[cel-mir-39])×100。4.动物模型根据视觉与眼科协会关于眼科与视觉研究的声明要求饲养动物，本研究采用的是雄性的gk糖尿病大鼠(6周龄)，体重约200g作为糖尿病动物模型(gk大鼠购于南京大学模式动物研究中心)。gk大鼠每日按12小时白天/12小时黑夜周期饲养20周后，将mir-15b过表达慢病毒(由上海吉凯生物有限公司提供)对gk大鼠眼球进行球后注射。针对同一只gk大鼠，一侧眼球注射mir-15b过表达病毒而对侧眼球注射阴性对照慢病毒。每只眼球注射剂量为2ul(含1×106病毒量)。gk大鼠眼球后注射20周进行安乐死处理后，剥离视网膜并进行后续分析。5.mir-15b原位杂交组织化学分析将注射mir-15b过表达慢病毒组及阴性对照组gk大鼠视网膜进行mir-15b表达原位杂交分析。视网膜使用4％的多聚甲醛固定过夜，然后使用oct(tissue-teko.c.t.compound)进行包埋，之后使用冰冻切片机对样本进行切片，切片厚度为：12μm。地高辛标记的原位杂交探针购于exiqon。将地高辛标记的原位杂交探针溶于缓冲液中(包含50％的去离子甲酰胺；0.3m的nacl；20mmtrishcl，ph8.0；5mmedta；10mmna2hpo4，ph8.0；10％硫酸葡聚糖；1×denhardt's溶液；0.5mg/ml酵母rna)，得到地高辛探针混合液，将地高辛探针混合液滴加于切片上后孵育12小时。然后用1×ssc冲洗样本3次。再用抗地高辛标记的辣根过氧化物酶抗体孵育2小时后，再用3，3’-二氨基联苯胺孵育15分钟显色。所有切片使用显微镜按40倍放大倍数拍摄照片(奥林巴斯显微镜)。6.视网膜铺片免疫荧光铺片分析将注射mir-15b过表达慢病毒组及阴性对照组gk大鼠眼球用4％多聚甲醛固定4小时后轻轻剥离出视网膜及玻璃体血管。视网膜放到0.5％聚乙二醇辛基苯基醚中4℃过夜孵化后用pbs液冲洗3次，在室温下带用alexa488的gs-ib4过夜标记。标记gs-ib4后，每个视网膜被切成四瓣用来铺片供显微镜照片和观察(奥林巴斯显微镜系统)。(都是浓度百分数，此处约定俗成不用说明----杨)7.实时荧光定量pcrhrmvec细胞与mir-15b及nc(阴性对照)孵育24小时后，通过荧光定量pcr检测vegf的mrna表达水平，检测试剂盒购自sybr-green试剂盒(takara,大连,中国)。8.测量mir-15b靶点和荧光素酶检测根据mir-15b与vegf结合位点分析，分别克隆vegf与mir-15b结合的野生型和突变型的序列(序列如图2所示)，并构建入pmir-reporttm(ambion,austin,tx)载体中进行分析，并以空载体pmir-reporttm作为参照。分别将重组载体导入hela细胞中，分组为：1)野生型[3’utr-vegf(wt)]+nc或mir-15b；2)突变型[3’utr-vegf(mut)]+nc或mir-15b；3)空病毒(3’utr-blank)+nc或mir-15b。并与转染48小时后使用双荧光素酶检测试剂盒(promega,madison,wi)进行荧光素酶活性检测。9.统计学分析正态分布资料用shapiro-wilk检验。百分比用分类变数，连续变量用均数±标准差或者中位数和四分位数来表示。分类数据用χ2检验。连续变量用t检验或mann-whitneyu检验。血浆microrna-15b水平对数处理后分析。校正了性别和年龄，microrna-15b和vegf的相关关系用斯皮尔曼偏相关分析。在计算microrna-15b水平和糖尿病视网膜病变的相关危险度；及microrna-15b水平和不同程度的糖尿病视网膜病变[非增殖性糖尿病视网膜病变(i-iii)和增殖性糖尿病视网膜病变(iv-vi)])的相关危险度用的是二元和多项逻辑斯蒂回归分析法。协变量的选择是根据这些变量与microrna-15b水平与糖尿病视网膜病变的潜在风险进行的。最终进入模型的协变量是：年龄、性别、口服药、糖尿病的病程、高血压、收缩压、载脂蛋白a、载脂蛋白b和糖化血红蛋白。统计学分析软件用的是sas9.3(sasinstitute,cary,nc).p值<0.05有统计学意义。10.结果一.循环血中差异microrna的测序分析为了检测循环血中与vegf相关的micrornas，采用增殖性糖尿病视网膜病变(pdr)和非增殖性糖尿病视网膜病变(ndr)各3例，用患者外周血进行micrornas芯片检测，结果见图1a，达到选出标准的micrornas有14个。选出的标准是：1.倍数>1.5或<0.667；2.fdr<0.01；3.目标为vegf的mirsvr和phastcons评分，见图1b。在这14个选出的microrna中与vegf相关性最强的是mir-15b二.糖尿病视网膜病变组患者(dr)和无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者(ndr)血浆microrna-15b水平和临床特点。表1糖尿病视网膜病变组患者(dr)和无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者组(ndr)microrna-15b水平和临床特点*continuousvariableswereexpressedasmean±standarddeviationormedian(interquartilerange)asappropriate.(连续变量用平均值±标准偏差或中位数(四分位间距)表示。)表1中，patientswithoutdr(无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者)，patientswithdr(糖尿病视网膜病变患者)，age(years)年龄(岁)，male/female(男/女)，bodymassindex(kg/m2)体重指数(kg/m2)，waist-hipratio(腰臀比)，diabetesdurations(years)糖尿病病程(年)，hypertension,n(％)高血压，hypertensiondurations(years)高血压病程(年)，familyhistoryofdiabetes,n(％)糖尿病家族史，familyhistoryofhypertension,n(％)高血压家族史，sbp(mmhg)收缩压，dbp(mmhg)舒张压，insulinusage,n(％)胰岛素使用率，oraldrugusage，口服药使用率，fastingglucose(mmol/l)空腹低血糖，hba1c糖化血红蛋白，tc(mmol/l)总胆固醇，tg(mmol/l)甘油三酯，hdl(mmol/l)高密度脂蛋白，ldl(mmol/l)低密度脂蛋白，apoa载脂蛋白a，apob载脂蛋白b，bun(mmol/l)尿素氮，ua(μmol/l)尿酸，cr(μmol/l)肌酐，vegflevel(pg/ml)血管内皮生长因子。microrna-15b的对数值(log-transformed)。由表1可以看出，dr组患者mir-15b水平下降而vegf水平升高。在校正了年龄和性别后统计学分析显示mir-15b和vegf呈负相关(r＝–0.13,p<0.05)。表2不同浓度microrna-15b与dr风险的关系levelsofmicrorna-15b(microrna-15b水平)or195％ci95％ci1stquartile(第1四分位数)1referencereference2ndquartile(第2四分位数)0.49(0.22-1.07)(0.12-1.00)3rdquartile(第3四分位数)0.34(0.16-0.76)(0.08-0.67)4thquartile(第4四分位数)0.16(0.07-0.36)(0.03-0.31)foreach2-foldincrease(倍次增加)0.60(0.47-0.76)(0.38-0.72)1adjustedforageandsex.(1校正年龄和性别)2adjustedforage,sex,oraldrug,diabetesduration,hypertensionduration,sbp,apoa,apobandhba1c.(2校正年龄，性别，口服药物，糖尿病病程，高血压病程，收缩压，载脂蛋白a，载脂蛋白b和糖化血红蛋白。)表2中显示血浆中mir-15b不同表达水平与dr发病风险的关联性。结果显示，dr发病风险的升高与mir-15b浓度水平呈负相关性(p趋势<0.001)的升高，即mir-15b水平每增加2倍则dr发病风险降低48％。而将mir-15b浓度进行四分位分组并经校正后，mir-15b各浓度区间相较于其最低浓度区间，dr发病风险从0.34(95％ci：0.12-1.00)下降到0.23(95％ci：0.08-0.67)和0.10(95％ci：0.03-0.31)。表3microrna-15b表达水平与dr患病风险(按疾病分期进行分层)的相关性1adjustedforageandsex.(1校正年龄和性别。)2adjustedforage,sex,oraldrug,diabetesduration,hypertensionduration,sbp,apoa,apobandhba1c.(2校正年龄，性别，口服药物，糖尿病病程，高血压病程，收缩压，载脂蛋白a，载脂蛋白b和糖化血红蛋白。)依据dr的不同病变程度进行危险分层后，与血浆中不同浓度水平mir-15b进行相关性分析(见表3)。结果发现，mir-15b每增加2倍，第i-iii期和iv-vi期的dr风险分别降低46％和42％。而与mir-15b最低水平区间相比较，并经校正后，发下在其他高表达水平区间的mir-15b中，i-iii期dr患者从0.20(95％ci：0.06-0.68)变为0.49(95％ci：0.16-1.46)和0.06％ci：0.02-0.23)。dr患者在iv-vi期的相应or值分别为0.45(95％ci：0.16-1.25)至0.28(95％ci：0.09-0.82)和0.16(95％ci：0.06-0.48)。三.mir-15b对vegf的直接影响验证vegf作为mir-15b靶基因的检测中，合成野生型vegf3'-utr区域[3'utr-vegf(wt)]和突变型vegf3'-utr区域[3'utr-vegf(mut)]序列并克隆入质粒载体。结果发现，共转染mir-15b和3'utr-vegf(wt)或3'utr-vegf(mut)或空载体入hela细胞后，仅发现3'utr-vegf(wt)载体荧光素酶活性显著性降低(p<0.01)，而对于3'utr-vegf(wt)或空载体则无任何影响(见图2)。以上结果说明，mir-15b通过3'-utr区域可直接调控vegf的表达。四.mir-15b对gk大鼠视网膜病变的影响为验证mir-15b对糖尿病视网膜病变的影响，用mir-15b过表达慢病毒对gk大鼠眼球进行球后注射。20周后，收集gk大鼠的视网膜，并使用mir-15b探针针对gk大鼠视网膜进行原位杂交组织化学分析，并对视网膜进行免疫荧光铺片(图3)分析。原位杂交组织化学分析显示let-mir-15注射可显著性增加mir-15在视网膜中的表达(图3a)；同时，免疫荧光铺片分析结果显示，mir-15b过表达后，可减少血管畸形、微动脉瘤、毛细血管的非灌注和荧光素渗漏，减缓gk大鼠中由糖尿病所诱导的视网膜病变的发生发展(图3b)。结论：vegf是导致糖尿病视网膜病变发生和发展的重要病理因素，糖尿病视网膜病变患者mir-15b水平下降而vegf水平升高。在校正了年龄和性别后统计学分析显示mir-15b和vegf呈负相关。mir-15b通过3'-utr区域可直接调控vegf的表达，用mir-15b过表达慢病毒对gk大鼠眼球进行球后注射20周后gk大鼠视网膜病变较阴性对照组好转。mir-15b可以预防和治疗糖尿病视网膜病变，循环血中mir-15b水平可以预测和诊断糖尿病视网膜病变。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12