递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用与流程

文档序号:15857282发布日期:2018-11-07 11:12阅读:975来源:国知局
递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用与流程
本发明涉及分子生物学
技术领域
,具体涉及一种递送融合型rna结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白类药物在医药领域中的比重越来越大,靶向递送蛋白类药物,特别是在组织和细胞类的蛋白药物,是整个蛋白类药物应用最为重要的环节。目前,蛋白类药物的递送手段包括:通过蛋白融合穿膜肽解决跨细胞递送的问题,利用微球或水凝胶解决蛋白质缓释的问题,通过靶向型纳米颗粒或纳米凝胶解决组织和细胞靶向性问题。然而,这些手段机制复杂,不易调控。近年来,外泌体作为细胞间蛋白和核酸信息分子传递的手段,得到越来越多的重视。外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡,其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。然而,但如何利用外泌体干预内源蛋白,目前缺乏理想策略。rna结合蛋白通过转录后调控方式调节基因表达,其中有相当比例通过增加mrna稳定性和翻译效率,促进基因表达,在多种疾病中扮演重要角色。这类rna结合蛋白是理想的药物靶点,但递送手段和干预手段非常有限,如何靶向干预其功能成为瓶颈问题。技术实现要素:本发明要解决的技术问题是提供一种递送融合型rna结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:设计一种递送融合型rna结合蛋白的表达载体,所述表达载体包括融合蛋白序列和rna结合蛋白序列;所述融合蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白;所述rna结合蛋白序列包括rna结合蛋白全序列或rna结合蛋白结构域序列。优选的,所述融合蛋白为溶酶体相关膜蛋白。优选的,所述rna结合蛋白为人抗原r(hur)。提供一种所述递送融合型rna结合蛋白的表达载体的制备方法,包括以下步骤:(1)trizol提取小鼠成纤维细胞总rna;(2)利用promegam-mlv反转录酶对rna进行反转录得小鼠成纤维细胞cdna;(3)以反转录cdna为模板,扩增融合蛋白和rna结合蛋白目的条带;(4)将目的条带用限制性内切酶酶切连入表达载体,即得。设计一种含所述的递送融合型rna结合蛋白的表达载体的外泌体,其制备方法为:将所述载体与包装质粒一起共转染hek293t细胞包装病毒,即得能够产生该融合蛋白的病毒;将该病毒感染外泌体包装细胞,如间充质干细胞mscs,收集感染细胞分泌的外泌体,即可获得目标外泌体。优选的,所述包装质粒为pspax2和/或pmd2.g。将上述表达载体或外泌体在药物递送载体中应用。将上述表达载体或外泌体在rna调控的相关疾病治疗中应用。与现有技术相比,本发明的有益技术效果在于:1.本发明选取定位于溶酶体和外泌体的蛋白整体或者其定位信号肽作为融合蛋白的标签蛋白,该蛋白既能实现目标融合蛋白高效装载进入外泌体,又能保障该目标融合蛋白进入受体细胞后能够有效进入溶酶体,将其所募集的内源rna分子降解,达到干预内源基因功能的目的。2.本发明选取外泌体作为递送融合型rna结合蛋白的手段,创建了一种高效的递送改造的rna结合蛋白的方法,能够在体内发挥不同于内源天然rna结合蛋白的功能。3.本发明发现该递送策略主要靶向全身多系统的巨噬细胞,能够高效递送目标蛋白至巨噬细胞的溶酶体,为有效干预巨噬细胞基因表达提供了重要手段。附图说明图1为(a)pcdna3.1-hur-lamp2b的结构示意图;(b)pwpi-hur-lamp2b的结构示意图;(c)pcdna3.1-lamp2b-hur的结构示意图;(d)pwpi-lamp2b-hur的结构示意图;图2为融合表达载体转染外泌体包装细胞外泌体的示意图;图3为粒径分析仪分析外泌体数量和大小分布;图4为电镜分析外泌体结构图;图3和图4中,从左至右依次为对照组、lamp2b-hur组和hur-lamp2b组;图5为westernblot检测外泌体及包装细胞中融合蛋白表达图;图6改构外泌体靶向巨噬细胞的荧光图;图7为改构外泌体高效进入溶酶体的荧光图;图8为改构外泌体降低天然蛋白靶基因mir-155。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式,但以下实施例只是用来详细说明本发明,并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明,均为常规仪器设备;所涉及的试剂如无特别说明,均为市售常规试剂;所涉及的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。溶酶体相关膜蛋白(lamps)是位于溶酶体膜上的一组高糖基化跨膜蛋白,lamp2b是维持溶酶体膜完整性得蛋白之一,参与分子伴侣介导自噬、胆固醇运输和抗原提呈等重要生理过程。人抗原r(hur)是最早发现的rna结合蛋白之一,可增加多种生长因子、细胞因子mrna的稳定性,从而上调蛋白质表达。实施例一:构建rna结合蛋白lamp2b-hur外泌体构建具体步骤如下:(1)trizol提取小鼠成纤维细胞总rna;(2)利用promegam-mlv反转录酶对rna进行反转录得小鼠成纤维细胞cdna;反应体系如表1所示:表1反应体系rna模板2μg5×rtbuffer4μldntp混合液(10mm)2μl0.1mdtt2μlm-mlv逆转录酶1μl总体系20μl将上述试剂混匀,低速短离心,置于37℃恒温箱中作用1~2h,-20℃保存。(3)以反转录cdna为模板,扩增目的条带;引物和pcr反应体系如表2和表3所示:表2反应引物引物名称引物序列lamp2b5fatccgctagcggtcgccaccatgtgcctctctccggttlamp2b5rgtcactcgagcataaaggcaagtaccctttgaalamp2b3fgtcactcgaggtcacatccggaggtgcagaatgggagatgaatttcalamp2b3ratccggatccttagtgttacagagtctgatatcchurfgccctcgagcaatgtctaatggttatgaagachurrccctccggatttgtgggacttgttggttttgaag表3反应体系pcr反应条件为:预变性,95℃3min;循环,95℃15s,58℃15s,72℃30s~2min(随产物长短而定),共设30个循环。(4)克隆:首先将lamp2b5f/r的pcr产物通过限制性内切酶nhe1和xho1克隆至pcdna3.1载体得pcdna3.1-lamp2b5;然后将lamp2b3f/r的pcr产物再通过限制性内切酶xho1和bamh1克隆至前述pcdna3.1-lamp2b5载体得pcdna3.1-lamp2b;最后将hur的pcr产物通过限制性内切酶xho1和bspe1连入前述pcdna3.1-lamp2b载体得pcdna3.1-hur-lamp2b,载体的结构如图1(a)所示。(5)亚克隆:利用lamp2b5f和lamp2b3r为引物,以pcdna3.1-hur-lamp2b为模板;采用高保真的pfumix酶,扩增融合片段;反应体系如表4所示:表4反应体系反应条件为:预变性,95℃3min;循环,95℃15s,58℃15s,72℃2min,共设30个循环。(6)将步骤(5)的pcr产物通过限制性内切酶pme1连入pwpi载体,得pwpi-hur-lamp2b融合表达载体,载体的结构如图1(b)所示。(7)测序确立成功后,与包装质粒(pspax2及pmd2.g)一起共转染hek293t细胞包装病毒,备用。此时,融合蛋白lamp2b-hur被包装进入外泌体,并随外泌体分泌到细胞外,融合表达载体pwpi-hur-lamp2转染外泌体包装细胞外泌体的示意图如图2所示。实施例二:构建rna结合蛋白hur-lamp2b外泌体(1)cdna反转录同实施例一。(2)以反转录cdna为模板,扩增目的条带;引物和pcr条件如表5和表6所示:表5pcr引物引物名称引物序列lamp2bfatccgctagcggtcgccaccatgtgcctctctccggttlamp2bratccggatccgtgttacagagtctgatatcchurfgccggatccatgtctaatggttatgaagachurrcccgaattcttatttgtgggacttgttggttttgaag表6pcr反应体系反应条件如下:预变性,95℃3min;循环,95℃15s,58℃15s,72℃30s~2min(随产物长短而定),共设30个循环。(3)克隆:首先将引物lamp2bf和lamp2br的pcr产物通过限制性内切酶nhe1和bamh1连入pcdna3.1载体得pcdna3.1-lamp2b′;然后将引物hurf和hurr的pcr产物通过限制性内切酶过bamh1和ecor1连入前述pcdna3.1-lamp2b′载体得pcdna3.1-lamp2b-hur,载体的结构如图1(c)所示。(4)亚克隆:利用lamp2bf和hurr为引物,以pcdna3.1-lamp2b-hur为模板;采用高保真的pfumix酶,扩增融合片段;反应体系如表7所示:表7pcr反应体系反应条件为:预变性,95℃3min;循环,95℃15s,58℃15s,72℃2min,共设30个循环。(5)将步骤(4)的pcr产物通过限制性内切酶pme1连入pwpi载体,得pwpi-lamp2b-hur融合表达载体,载体的结构如图1(d)所示。(6)测序确立成功后,与包装质粒(pspax2及pmd2.g)一起共转染hek293t细胞包装病毒,备用。此时,融合蛋白hur-lamp2b被包装进入外泌体,并随外泌体分泌到细胞外。实施例三:改构外泌体理化性质验证试验将实施例一和实施例二构建好的两个融合表达载体分别与包装质粒同时转染外泌体包装细胞hek293t,获得表达融合蛋白的病毒颗粒。将该病毒感染外泌体包装细胞,如骨髓间充质细胞msc,然后在无血清条件下培养,48~72小时之间收集外泌体,通过外泌体分离提取试剂盒exoquick提取外泌体。鉴定外泌体的数量、大小、融合表达的效率。具体方法和结果如下:将收集的外泌体用pbs按1:1000稀释,然后通过nanosight进行外泌体数量和大小的鉴定(如图3所示),发现三种外泌体的粒径大小相似,均在50~200nm的区间内。通过电镜检测进一步明确外泌体的形态(如图4所示),发现三种改构外泌体三种改构外泌体的形态完整,结构相似。为了验证融合表达的效率,将收集的外泌体进行蛋白裂解,融合通过westernblot进行检测,观察hur-lamp2b/lamp2b-hur的表达水平(如图5所示);同时western检测还验证了外泌体marker的表达。实施例四:改构外泌体动物试验(1)细胞水平,将收集的外泌体进行荧光标记,然后与待培养细胞共孵育,24小时后,免疫荧光观察外泌体进入目的细胞的效率。裂解细胞,观察融合rna结合蛋白的表达效率及对靶基因表达的影响。动物水平,将收集的外泌体进行荧光标记,然后尾静脉注射入小鼠体内,24小时后,小动物荧光成像观察外泌体在全身各个组织的定位。在此基础上,进一步收集各种组织,免疫荧光观察外泌体进入目的细胞的效率。裂解细胞,观察融合rna结合蛋白的表达效率及对靶基因表达的影响。如图6所示,动物实验证实外泌体递送能够有效进入肝脏、脾脏等富含巨噬细胞的组织。(2)如图7所示,在细胞水平,可以发现外泌体进入巨噬细胞raw264.7的效率接近100%。荧光标记的外泌体进入细胞后,荧光示踪显示改构外泌体整体或部分能够高效进入溶酶体,尤以富含溶酶体的巨噬细胞显著。如图8所示,递送融合lamp2b-hur后,对细胞内源基因mir-155检测发现,该系统可以有效将内源mir-155表达降低至50%以下。上述结果原理为:融合表达载体感染外泌体包装细胞,在外泌体包装细胞,融合蛋白被包装进入外泌体,并随外泌体分泌到细胞外。收集上述外泌体,当上述外泌体进入受体细胞,部分融合蛋白可以重新释放出来,其rna结合结构域可以竞争性结合内源rna分子,而其引导蛋白将融合蛋白及其携带的rna分子带入溶酶体,最终降解rna。上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明,但是,所属
技术领域
的技术人员能够理解,在不脱离本发明宗旨的前提下,还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更,形成多个具体的实施例,均为本发明的常见变化范围,在此不再一一详述。当前第1页12
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