本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测粪便样品中大肠杆菌o157:h7活性的荧光raa引物和探针及检测方法。
背景技术：
大肠杆菌o157:h7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。大肠杆菌o157:h7具有较强的耐酸性，ph2.5-3.0，37℃可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，75℃1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/l的余氯浓度杀灭。大肠杆菌o157:h7的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长。因此，为及时有效发现大肠杆菌o157:h7，将该细菌防范于国门之外，建立快速、敏感、特异的检测方法十分必要。
随着全球化发展，方便、快捷的交通运输工具使旅游及不同国家和地区动物、动物产品的跨境移动日益频繁，也给传染病的传播和流行创造了有利条件。此外，大肠杆菌o157:h7早期感染呈现不典型症状，与其它细菌感染症状类似，很难区分。而且目前尚无针对大肠杆菌o157:h7感染的有效治疗药物，无疑进一步加大了大肠杆菌o157:h7的防控。因此，建立快速诊断大肠杆菌o157:h7感染的实验室方法显得尤为重要。
传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于大肠杆菌o157:h7的检测。目前，国内外已建立的大肠杆菌o157:h7检测方法有实时pcr检测方法、半巢式pcr检测方法、lamp检测方法等，但pcr方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而lamp方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用lamp方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测大肠杆菌o157:h7活性的荧光raa引物和荧光探针以及使用该荧光raa引物和荧光探针对大肠杆菌o157:h7活性的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测粪便样本中的大肠杆菌o157:h7活性。
本发明的一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌o157:h7的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：
1)序列表中seqid№：1所示核苷酸序列和序列表中seqid№：2所示核苷酸序列；
2)在高严谨条件下可与序列表中seqid№：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中seqid№：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。
具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。
上述高严谨条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。
所述具有相同功能具体包括能用于检测或特异性扩增大肠杆菌o157:h7基因组中的特异保守区域核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌o157:h7的探针，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：
1)所述探针的核苷酸序列为：
5'-gaggcaatagtcaatcatcttcaagagccnmnagcgtaagcagaaac-3'，
其中，所述n代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述m代表具环状结构的化合物；再具体的，所述n代表任意荧光基团或荧光淬灭基团修饰后的核苷酸；
2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。
具体的，所述n代表携带有荧光素基团fam的胸腺嘧啶脱氧核苷酸fam-dt或携带有荧光淬灭基团bhq的胸腺嘧啶脱氧核苷酸bhq-dt，所述m代表四氢呋喃。
具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。
上述高严谨条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。
所述具有相同功能具体包括能用于检测或特异性扩增大肠杆菌o157:h7基因组中的特异保守区域核苷酸序列。
具体的，所述探针的核苷酸序列为序列表中seqid№：3所示核苷酸序列。
本发明的又一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌o157:h7的组合物，所述组合物包括下述1)和2)：
1)本发明所述的引物对；
2)本发明任一所述的探针。
本发明的还一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌o157:h7的试剂盒，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：
1)本发明所述的引物对；
2)本发明任一所述的探针；
3)本发明所述组合物。
具体的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6。
本发明的再一个目的是提供一种大肠杆菌o157:h7的检测方法，所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：
1)本发明所述的引物对；
2)本发明任一所述的探针；
3)本发明所述组合物。
具体的，所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：
1)当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6；
2)提取待检测样品的dna作为模板，进行raa反应，所述raa反应的反应温度包括37-39℃，再具体的，为39℃；反应时间包括20分钟以上。
本发明的又一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在检测大肠杆菌o157:h7中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在制备检测大肠杆菌o157:h7相关产品中的应用。
本发明的有益效果包括：
本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测大肠杆菌o157:h7活性的荧光raa引物和荧光探针以及该荧光raa引物和荧光探针在检测大肠杆菌o157:h7中的应用，该荧光raa引物和荧光探针可以快速、定性检测血清样本中的大肠杆菌o157:h7。
本发明提供的荧光raa引物和荧光探针，应用该荧光raa引物和荧光探针检测大肠杆菌o157:h7时，不依赖于昂贵的pcr仪器，且检测时间较pcr方法或荧光pcr显著缩短，而灵敏度与荧光pcr相当甚至更高。
在raa反应过程中，大肠杆菌o157:h7dna通过利用重组酶代替pcr高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止dna链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以dna为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟.此外，raa技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套raa多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式pcr技术无法相比的。raa技术不依赖于pcr仪器的便捷性能，且检测时间较pcr方法或荧光荧光pcr显著缩短，而灵敏度与荧光pcr相当甚至更高，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。
本发明可以实现单管现场、快速检测大肠杆菌o157:h7，与其它检测技术相比具有以下优点：
1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；
2、不依赖于pcr等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；
3、本发明提供的荧光raa引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为灵敏度实验结果图。
图2为特异性实验结果图。
图3为临床样品检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测大肠杆菌o157:h7活性的荧光rt-raa引物、探针的设计
针对于大肠杆菌o157:h7的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光raa探针，其序列分别是：
正向引物，如序列表中seqid№：1所示核苷酸序列：
5'-tccacattgaggggactggaggcaatagtc-3'
反向引物，如序列表中seqid№：2所示核苷酸序列：
5'-gatcacctcctactgctccgattccagatg-3'
寡核苷酸探针，如序列表中seqid№：3所示核苷酸序列：
5'-gaggcaatagtcaatcatcttcaagagcc(fam-dt)(thf)(bhq-dt)agcgtaagcagaaac-3'；
其中：
fam-dt表示携带有荧光素基团fam(6-carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；
thf表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；
bhq-dt表示携带有荧光淬灭基团bhq(blackholequencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
实施例2、一种用于检测大肠杆菌o157:h7的荧光raa方法的建立
(一)荧光raa反应
1)粪便样品中dna的提取：所述粪便样品中dna的提取可以采用dna提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及raa反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的raa基础试剂盒)，以本实施例步骤1)提取的粪便样品中dna为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：
25μlraa反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司raa基础试剂盒提供)；
实施例1设计的正向引物、反向引物(10μm)各2.1μl；
0.6μl实施例1设计的探针(10μm)；
1μl步骤1)提取的粪便样品中dna模板；
加16.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司raa基础试剂盒提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μl280mm醋酸镁溶液并混匀。
(二)荧光检测
将上述反应管放置于raaf-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应20min，进行荧光检测。
阴性对照：fam通道无扩增曲线，且无tt值；
阳性对照：fam通道有扩增曲线，tt值均≤8min
上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
样品检测结果判读：
当所检测的样品fam通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定大肠杆菌o157:h7阳性；
当所检测的样品fam通道无扩增曲线，且tt值显示为undet或nott，质量控制正常时，可判定大肠杆菌o157:h7阴性。
(三)灵敏度实验
标准品dna的制备：大肠杆菌o157:h7标准菌株及分离菌株在bpw培养基中扩培4－8小时，加入dna提取液加热100℃5min，进行分装备用，冻存于-80℃。
该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×102copies/ml、10copies/ml的阳性标准品dna作为检测限参比品，raa荧光反应过程、反应体系(除模板dna浓度不同，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同。
通过该实验表明该检测方法的检测限达到10copies/ml，具体实验结果如图1所示。
图1中106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、10拷贝分别表示浓度为1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×102copies/ml、10copies/ml的阳性标准品dna的扩增曲线，阴性为阴性对照，横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/ml。
(四)特异性实验
该实验选择与大肠杆菌o157:h7具有相同感染感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为沙门氏菌、霍乱弧菌以及金黄色葡萄球菌。利用dna提取试剂盒提取以上样本中的dna作为模板进行实验，raa荧光反应过程、反应体系(除模板dna种类不同外，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同。
特异性实验结果如图2所示。
图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图2所示结果表明，4种特异性参考品均未有扩增曲线，只有大肠杆菌o157:h7检测出相应的特异性扩增曲线，无交叉反应，说明该检测方法的特异性良好。
(五)临床阳性样品检测实验
该实验室选择2例临床分离阳性样本对该方法进行检测、验证。raa荧光反应过程、反应体系(除模板dna不同外，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同具体实验结果如图3所示。
图3中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图3实验数据表明该检测方法均能检出2例临床分离阳性样本，扩增效果优异。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>宁波国际旅行卫生保健中心
<120>一种用于检测大肠杆菌o157:h7活性的荧光raa引物、探针及检测方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tccacattgaggggactggaggcaatagtc30
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gatcacctcctactgctccgattccagatg30
<210>3
<211>47
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>n=fam-dt
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>m=thf
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>n=bhq-dt
<400>3
gaggcaatagtcaatcatcttcaagagccnmnagcgtaagcagaaac47