本发明涉及一种辅助检测急进高原低压低氧环境相关心肌损伤的标志物。
背景技术：
microrna(mirna)是一类高度保守的非编码rna，通过与靶基因mrna中特异的互补序列结合，诱导mrna降解或抑制其翻译为蛋白质，在转录后水平对基因表达起着负调控作用。mirna在许多重要的生命过程(如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育、细胞凋亡等)均起着关键作用。目前已知的人类mirna约2000余个。研究人员已经在各种类型体液如血液、尿液、腹水、胸水中分离纯化出mirna。这些mirna可在不同的病理生理状态下发生不同的快速、高灵敏度的变化，提示通过mirna转运可以实现细胞间信息交流。mirna自身也可以作为良好的疾病诊断和判断预后的生物标志物。高原低压低氧暴露导致的心肌损伤是急性高原病(acutemountainsickness,ams)很重要的一部分。30％的ams可能发生心源性猝死。由于高原低压低氧导致的心脏疾病的发生发展比较复杂，目前还没有明确的诊断标准和干预策略，对于高原低压低氧导致的心肌损伤还没有简便易行的诊断和评估方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种辅助检测急进高原低压低氧环境相关心肌损伤的标志物。本发明首先提供了用于检测mir-144-3p表达水平的产品在制备用于辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤的试剂盒中的应用。本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测mir-144-3p表达水平的产品；所述试剂盒的用途为辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤。本发明还保护用于辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤的系统，包括用于检测mir-144-3p表达水平的物质和数据处理装置；所述数据处理装置内设模块1和模块2，所述模块1具有如下(a1)所示功能，所述模块2具有如下(a2)所示功能：(a1)分别比较取自待测者和健康对照者的离体样本中mir-144-3p的表达水平；(a2)根据(a1)的比较结果按照如下确定所述待测者是否患有低压低氧导致的心肌损伤：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体样本中mir-144-3p的表达水平上调，则所述待测者患有低压低氧导致的心肌损伤；反之，则所述待测者不患有低压低氧导致的心肌损伤。以上任一所述检测mir-144-3p表达水平的产品为特异引物组合；所述特异引物组合由茎环引物、上游引物和下游引物组成；所述茎环引物为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列2所示的单链dna分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；所述上游引物为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列3所示的单链dna分子；(b4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；所述下游引物为如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列4所示的单链dna分子；(b6)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子。本发明还保护所述特异引物组合在制备用于辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤的试剂盒中的应用。本发明还保护含有所述特异引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途为辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤。本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本发明还保护mir-144-3p作为标志物在辅助诊断低压低氧导致的心肌损伤中的应用。本发明还保护一种辅助诊断待测者是否患有低压低氧导致的心肌损伤的方法，包括如下步骤：(c1)分别比较取自待测者和健康对照者的离体样本中mir-144-3p的表达水平；(c2)根据(c1)的比较结果按照如下确定所述待测者是否患有低压低氧导致的心肌损伤：若与所述健康对照者相比，所述待测者的离体样本中mir-144-3p的表达水平上调，则所述待测者患有低压低氧导致的心肌损伤；反之，则所述待测者不患有低压低氧导致的心肌损伤。以上任一所述离体样本具体可为离体血浆样本。以上任一所述mir-144-3p如序列表的序列1所示。以上任一所述低压低氧导致的心肌损伤具体可为急进高原低压低氧环境相关心肌损伤。本发明通过低压氧舱模拟高原低压低氧环境，建立低压低氧心肌损伤大鼠动物模型。应用高通量测序技术和生物信息学方法，分析低压低氧诱导的大鼠损伤心肌中mirna表达变化及其功能和调控机制，筛选与高原低压低氧心肌损伤相关的关键mirna，并进一步通过荧光定量pcr方法对心肌组织和血浆中关键mirna进行实验验证。通过本发明筛选的mirna可以辅助检测急进高原低压低氧环境相关心肌损伤。本发明对于急进高原低压低氧环境相关心肌损伤的诊断和评估有重要意义。附图说明图1为不同时间点大鼠心肌组织病理切片。图2为心肌组织中差异表达mirna的热图。图3为tam分析表达上调mirna的功能。图4为tam分析表达下调mirna的功能。图5为低压低氧7天大鼠心肌组织中mirna表达。图6为低压低氧7天大鼠血浆中mirna表达。图7为低压低氧不同时间点大鼠血浆中mir-144-3p表达。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中采用spss20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(_x±s)表示，两组间差异采用独立样本t检验，多组间差异采用方差检验，分析组间差异的显著性。以p＜0.05定义为差异具有统计学意义。实施例1、低压低氧心肌损伤大鼠动物模型构建及mirna表达谱分析一、动物实验实验动物：六周龄spf级sd大鼠96只，体重200±20g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号scxk(京)2016-0006。采用随机数字表法将96只sd大鼠随机分为如下各组(每组12只)：d3实验组(低压低氧暴露3天)：sd大鼠置于低压低氧模拟实验舱中饲养3天。d7实验组(低压低氧暴露7天)：sd大鼠置于低压低氧模拟实验舱中饲养7天。d14实验组(低压低氧暴露14天)：sd大鼠置于低压低氧模拟实验舱中饲养14天。d28实验组(低压低氧暴露28天)：sd大鼠置于低压低氧模拟实验舱中饲养28天。常压常氧对照组：sd大鼠置于低压低氧模拟实验舱外常压常氧环境中饲养。应用实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)模拟高原低压低氧条件。实验舱参数设定：模拟海拔高度7000米，升降速度10米/秒，舱内压力39.1kpa，舱内氧气压力9.022kpa。实验组大鼠置于实验舱内。实验舱运行时间为23h/日，昼夜比为12h/12h。二、超声心动图检查各组sd大鼠完成低压低氧实验当日出舱后立刻进行超声心动图检查。应用2％丙戊酸钠溶液将sd大鼠麻醉后，大鼠胸前褪毛，仰卧固定。将超声探头(频率17.5mhz)置于大鼠胸骨前，显示左室短轴切面。于乳头肌水平，应用m超声记录左心室运动曲线。分别测量舒张末期左室前壁厚度(lvawd)、左室后壁厚度(lvpwd)，左室舒张末期内径(lvidd)和收缩末期内径(lvids)，评估左心室结构。分别测量肺静脉峰值流速(pvpeakvelocity)和肺静脉峰压差(pvpeakgradient)，评估左心室舒张功能。计算左心室短轴缩短率(fs％)和射血分数(ef％)，评估左心室收缩功能。结果如表1所示。表1大鼠超声心动图检查结果超声心动图检查结果提示：①4组实验组大鼠的pvpeakvelocity和pvpeakgradient数值均低于对照组，其中低压低氧7天组大鼠的pvpeakvelocity和pvpeakgradient下降最为明显，与对照组比较，具有统计学意义(p<0.05)。提示低压低氧可造成左心室舒张功能受损，低压低氧暴露7天组大鼠左心室舒张功能受损最严重。②低压低氧暴露3天组和7天组大鼠左心室射血分数(lvef)和短轴缩短率(fs)均低于对照组。低压低氧暴露14天组和28天组大鼠左心室射血分数(lvef)和短轴缩短率(fs)均高于对照组。与对照组比较，低压低氧暴露7天组大鼠lvef和fs下降最为明显，具有统计学意义(p<0.05)。提示低压低氧暴露早期，低压低氧可造成心肌收缩功能下降。随着高原习服，大鼠左心室收缩功能逐渐恢复正常。三、心脏组织病理检查大鼠完成超声心动图检查后处死，取出心脏，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后称重，10％多聚甲醛固定。常规石蜡包埋切片，厚度4μm，he染色，光镜下观察心肌组织病理变化。结果如图1所示。其中，a为常压常氧对照组；b为低压低氧3天实验组；c为低压低氧7天实验组；d为低压低氧14天实验组；e为低压低氧28天实验组。心肌组织病理切片光镜下所见，常压常氧对照组大鼠心肌细胞界限清楚。可见肌原纤维和横纹，胞核清晰。肌浆未见变性和坏死。心肌细胞间毛细血管管腔内有红细胞，心内膜平滑。低压低氧暴露3天组可见心肌灶状变性和坏死，伴有炎性细胞灶状浸润和成纤维细胞增生，肌浆凝聚、横纹不清。低压低氧暴露7天组可见心肌粗细不均，间质增宽。血管扩张。个别心肌细胞可见断裂、肿胀。肌浆凝聚、红染、横纹不清。低压低氧暴露14天组可见心肌细胞排列紊乱、稀疏，间质增宽，血管扩张。心肌可见断裂、肿胀，肌浆凝聚、红染、横纹不清。心肌间质成纤维细胞增生明显，并有胶原纤维排列。心内膜下可见成片炎细胞浸润，成纤维细胞和胶原纤维增生。低压低氧暴露28天组可见心肌细胞排列明显稀疏，间质增宽。血管扩张。部分区域心肌间质出血明显，心肌细胞胞核减少。大鼠心肌组织病理结果提示，低压低氧暴露7天即可成功构建高原低压低氧心肌损伤动物模型。四、心肌组织mirna表达谱检测完成动物模型构建后，选取低压低氧暴露7天组和对照组大鼠作为研究对象，应用高通量测序技术，进行大鼠心肌组织mirna表达谱检测，筛选差异表达mirna。应用trizol试剂提取低压低氧暴露7天组和常压常氧对照组大鼠左心室心肌组织总rna(每组6只动物)。质检合格的rna进行文库构建。使用hiseq2500测序仪进行高通量测序，检测mirna表达谱。使用fastqc对原始序列进行检测，保留高质量的整洁序列(cleanreads)。使用cufflinks2.0对所有转录组结果进行汇总整合，并使用ensemble转录本数据库对获得的结果进行注释。使用cufflinks软件筛选差异基因。差异基因的筛选标准为同时满足以下条件：①在两个样本中测序读数之和》10的基因；②满足│log2(fc)│>1(上调2倍或下调2倍)；③同时满足p<0.05和fdr(falsediscoveryrate)<0.05。五、差异mirna的靶基因预测和go功能分析获取差异表达mirna后，使用david在线工具进行go功能富集和kegg信号通路富集分析。使用cytoscape3.3进行可视化，观察差异表达基因在信号通路上的富集情况。使用两个常用靶基因预测软件targetscan和miranda对差异表达mirna对应的靶基因进行预测。通过高通量测序，共筛选出18个差异表达mirna。其中15个mirna表达显著上调，3个mirna表达显著下调(图2)，其中上调的mirna包括mir-144-3p、mir-144-5p、mir-132-3p和mir-132-5p，下调的mirna包括mir-672-3p。六、差异表达mirna与疾病的关联分析利用tam(http://www.cuilab.cn/tam)软件对高表达mirna和低表达mirna分别进行功能、疾病、mirna家族和mirna簇富集分析。发现很多调控与氧化应激、细胞凋亡、自噬、炎症等紧密相关的功能基因(如nrf2、sirt2、foxo3、ho-1、sod1、nox4、bcl2、il-6等)的mirna包含在上述差异表达mirna中。利用tam软件对差异表达mirna功能、疾病、mirna家族和mirna簇富集分析结果见图3、4。根据预测的靶基因构建差异表达mirna在氧化应激反应中的可能信号通路，推测差异表达mirna可能通过nrf2、mtor等经典信号通路参与高原低压低氧诱发的氧化应激、细胞凋亡、炎症、自噬等病理生理过程，参与低压低氧诱导的心肌损伤。七、大鼠心肌组织中mirna表达采用荧光定量pcr检测步骤一的d7实验组和对照组心肌组织中mirna(mir-144-3p、mir-144-5p、mir-132-3p、mir-132-5p、mir-672-3p)的表达水平。五个mirna的序列特征见表2，扩增引物见表3。表2mirna序列特征mirnaid序列rno-mir-144-5pmimat0017130ggauaucaucauauacuguaagurno-mir-144-3pmimat0000850uacaguauagaugauguacu(序列1)rno-mir-672-3pmimat0017312acacacagucgccaucuucgarno-mir-132-3pmimat0000838uaacagucuacagccauggucgrno-mir-212-5pmimat0017158accuuggcucuagacugcuuacug表3扩增mirna的引物结果见图5。结果表明，荧光定量pcr检测的mirna表达趋势与mirna高通量测序方向一致。八、大鼠血浆中mirna表达采用荧光定量pcr检测步骤一的d7实验组和对照组血浆中5个mirna(mir-144-3p、mir-144-5p、mir-132-3p、mir-132-5p、mir-672-3p)的表达水平，结果见图6。五个mirna的序列特征见表2，扩增引物见表3。结果表明低压低氧7天，大鼠血浆和心肌组织中mir-144-3p的表达变化趋势一致。九、低压低氧暴露不同时间点大鼠血浆中mir-144-3p表达水平应用荧光定量pcr法分别检测对照组、d3实验组、d7实验组、d14实验组和d28实验组大鼠血浆中mir-144-3p的表达水平，结果见图7。结果提示，随着低压低氧暴露时间延长，血浆中mir-144-3p表达水平逐渐升高。上述结果表明，mir-144-3p为反映高原低压低氧心肌损伤的一种候选标志物。序列表<110>北京艾瑟尔生物医学研究有限公司<120>辅助检测急进高原低压低氧环境相关心肌损伤的标志物<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1uacaguauagaugauguacu20<210>2<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcacttacag45<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcggcaggtacagtatagatg21<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctcaactggtgtcgtgga18当前第1页12