本发明属于生物医学分子检测技术领域,具体涉及一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒。
背景技术
药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性,导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展,药物基因组学领域得到了迅猛发展,越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具,部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国fda已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息,涉及的药物基因组生物标记物42个。此外,部分行业指南也将部分非fda批准的生物标记物及其特性(如mgmt基因甲基化)的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。
药理学与遗传学结合的关键环节包括药物代谢动力学(pharmacokinetics,pk)和药物效应动力学(pharmacodynamics,pd)两方面。药物代谢动力学主要是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,侧重于阐明药物的体内过程;药物效应动力学主要研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制,其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化,侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量,实现个体化用药,从而提高药物治疗的有效性和安全性,防止严重药物不良反应的发生。
根据药物基因组生物标志物检测指导个体化用药主要包括两种类型:一是根据个体的遗传信息调整用药剂量,以增加药物疗效,减少药物不良反应的发生;二是根据个体的遗传信息确定用药的种类,避免应用针对特定基因型个体无效或可能产生严重药物不良反应的药物。药物剂量的调整往往需根据随机对照临床研究的结果;对目前缺乏随机对照临床研究的遗传变异,可依据基因型对药物药代动力学曲线下面积影响的大小估算用药剂量;当一个药物的反应性受多个基因或基因与环境因素间相互作用影响时,可根据国内国际大规模临床试验推导出的、纳入了个体基因型及其他因素的用药剂量计算公式确定用药剂量。常见药物代谢酶和药物作用靶点基因遗传变异检测结果对临床用药的指导建议。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒。
本发明的检测原理如下:
本发明的多重pcr检测试剂盒分别设计合成针对66种位点的pcr扩增特异性引物对和单碱基延伸引物,然后进行pcr扩增、sap反应和iplex单碱基延伸反应。样本单碱基延伸产物经过树脂脱盐,然后通过maldi-tof(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪分析,检测不同延伸产物间的分子量差异,确定这85个snp位点处的碱基类型,从而将进行基因分型,可直接判断基因型,从而根据不同基因分型的病人采用不同的治疗方式。
本发明的技术方案如下:
一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒,包括根据vkorc1、ugt1a1、hla-a、hla-b、tpmt、nat1、nat2、g6pd、f5、f2、ifnl3、apoe、comt、cyp1a2、cyp2b6、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a5、mtfhr、slco1b1、dpyd基因的多态性位点设计的在同一反应体系中反应的六十六pcr扩增引物对及在同一反应体系中反应的六十六单碱基延伸引物,其中,
上述六十六pcr扩增引物对包括第一至第六十六扩增引物对,第一至第六十六扩增引物对的正向引物依次如seqidno01~066所示,反向引物依次如seqidno067~132所示;上述六十六单碱基延伸引物包括第一至第六十六单碱基延伸引物,依次如seqidno133~198所示;
其使用方法包括如下步骤:
(1)以待检测基因组dna为模板,使用所述六十六pcr扩增引物对在一含有ringcap-taq酶和ringcapbuffer的pcr反应体系中进行pcr扩增反应,得pcr扩增反应液;
(2)将上述pcr扩增反应液与sap酶进行sap反应,得sap反应液;
(3)用上述六十六单碱基延伸引物对对上述sap反应液进行单碱基延伸反应;
(4)将步骤(3)所得的物料经树脂脱盐后,于spectrochip芯片上样,进行质谱检测,即成。
在本发明的一个优选实施方案中,所述pcr扩增反应的条件包括:95℃3min,1个循环;95℃20s,60℃30s,72℃20s,45个循环;72℃3min,1个循环。
进一步优选的,所述sap反应的条件包括:37℃40min,85℃5min,4℃∞。
更进一步优选的,所述单碱基延伸反应的条件包括:
第一阶段共40个循环:每一循环包括:
94℃30s,1个循环,94℃5s,52℃5s,80℃5s,5个循环;
第二阶段共1个循环:72℃3min。
在本发明的一个优选实施方案中,所述ringcap-taq酶由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成,比例0.8~1.2∶0.8~1.2∶0.8~1.2。
进一步优选的,所述ringcap-taq酶由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成,比例1∶1∶1。
本发明的有益效果是:
1、本发明的多重pcr检测试剂盒能快速、特异、高效地检测22基因的上述85个snp位点的多态性,从而能对心脑血管疾病标准方案疗效进行预测,便于临床医生有针对性地制定治疗方案,对不同型别的患者采取区别对待及治疗,从而提高整个心脑血管疾病的诊疗水平;
2、本发明所提供的用于检测人22基因85个多态性的pcr扩增引物、单碱基延伸引物、检测试剂盒及其检测方法具有很高的临床应用价值,特别适合临床推广。
附图说明
图1是本发明实施例2检测的22基因中rs9923231位点质谱结果图。
图2是本发明实施例2检测的22基因中rs776746位点质谱结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒,包括根据vkorc1、ugt1a1、hla-a、hla-b、tpmt、nat1、nat2、g6pd、f5、f2、ifnl3、apoe、comt、cyp1a2、cyp2b6、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a5、mtfhr、slco1b1、dpyd基因的多态性位点设计的在同一反应体系中反应的六十六pcr扩增引物对及在同一反应体系中反应的六十六单碱基延伸引物;
上述六十六pcr扩增引物对依次包括第一至第六十六扩增引物对,第一至第六十六扩增引物对的正向引物依次如seqidno01~066所示,反向引物依次如seqdno067~132所示,具体如下表所示:
上述六十六单碱基延伸引物依次包括第一至第六十六单碱基延伸引物,依次如seqidno133~198所示,具体如下表所示:
其使用方法包括如下步骤:
(1)以待检测基因组dna为模板,使用所述六十六pcr扩增引物对在一含有ringcap-taq酶和ringcapbuffer的pcr反应体系中进行pcr扩增反应,得pcr扩增反应液;所述pcr扩增反应的条件包括:95℃3min,1个循环;95℃20s,60℃30s,72℃20s,45个循环;72℃3min,1个循环;所述ringcap-taq酶由taq酶、dna连接酶和dna末端修饰酶组成,比例0.8~1.2∶0.8~1.2∶0.8~1.2,优选比例1∶1∶1;
(2)将上述pcr扩增反应液与sap酶进行sap反应,得sap反应液;所述sap反应的条件包括:37℃40min,85℃5min,4℃∞;
(3)用上述六十六单碱基延伸引物对对上述sap反应液进行单碱基延伸反应;所述单碱基延伸反应的条件包括:
第一阶段共40个循环:每一循环包括:
94℃30s,1个循环,94℃5s,52℃5s,80℃5s,5个循环;
第二阶段共1个循环:72℃3min
(4)将步骤(3)所得的物料经树脂脱盐后,于spectrochip芯片上样,进行质谱检测,即成。
具体的,根据本发明的试剂盒中的主要试剂如下表所示:
实施例2实施例1的多重pcr检测试剂盒的检测实例
检测样本:edta抗凝的血液样本,来自福建省肿瘤医院体检部,采集自常规体检的健康成人。
主要仪器设备:
1、drmassarray质谱基因分析系统(广州达瑞生物技术股份有限公司);
2、ab-7500荧光定量pcr仪(美国应用生物系统公司(abi));
3、离心机(epponderf);
4、旋转振荡仪(上海)。
检测程序:
1、血样基因组dna纯化:使用天根生化的血液基因组提取试剂盒提取。
2、pcr扩增:以纯化后的血样dna为模板,以实施例1所提供试剂盒中针对85个位点多态性的pcr扩增引物对进行pcr扩增,反应体系如下,
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下:
3、sap反应:分别取上述5μlpcr扩增反应液加入2μlsap反应液进行sap反应,其中,sap反应液配方如下:
反应条件如下:
4、单碱基延伸反应:将上述sap消化液中分别加入2μl的延伸反应液,进行单碱基延伸反应,其中,延伸反应液配方:
;其中,单碱基延伸引物mix为实施例1所提供试剂盒中的用于检测85个位点多态性的单碱基延伸引物的混合物。
反应条件如下:
5、树脂脱盐:在每一个有样本的延伸反应液孔里加入41ul水然后离心。加入15mg洁净树脂(resin):轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimpleplate上,然后将dimpleplate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动),让树脂掉到孔里。用膜把板封好,放在旋转器上振荡摇匀15min。以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5min。
6、spectrochip芯片上样:用massarraytmrs1000自动点样仪进行体积测试(volumecheck)以找出合适的点样速度(dispensingspeed)。点样的合适体积是8-12nl±25%。以板上的样本进行volumecheck,然后用massarraytmrs1000自动点样仪将反应后的样本点到96点spectrochip(芯片)上。
7、质谱检测。
检测结果如图1和图2所示,将其与传统的基因测序法所检测的两个位点的测序结果进行比对,证实两种检测方法的检测结果完全吻合,这证明了本申请检测方法的可靠性。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110>厦门飞朔生物技术有限公司
<120>一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒
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