鉴定施氏鲟、西伯利亚鲟及其杂交后代的引物及方法与流程

文档序号:15457581发布日期:2018-09-15 01:33

本发明属于分子生物学领域,具体涉及鉴定西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代的引物及方法。



背景技术:

施氏鲟和西伯利亚鲟是我国的2个重要养殖品种。自然条件下,施氏鲟仅分布于黑龙江(阿穆尔河)水系,是黑龙江的特有种和重要经济鱼类,其生长速度较快,但抗病力差、不耐运输,而且对活饵过于依赖较难驯化,在养殖过程中死亡率较高,加大了鲟鱼养殖业的风险。而西伯利亚鲟主要分布于中亚和东欧,在我国额尔齐斯河水系有少量分布,其生长速度慢,但抗病力强,耐运输。

我国于2007年前后将西伯利亚鲟和施氏鲟的杂交组合繁育成功,因其正、反交的效果差别不大,所以统称为“西杂”。西杂较双亲有明显的生产优势,适应能力较强、生长速度较快、抗病力强、运输存活率高。西杂繁育成功之后,迅速在全国范围内推广养殖,现已成为东北、华北、华东、华中地区的主要养殖品种,是目前我国商品鲟鱼养殖规模与产量最大的品种。

在西杂及其亲本的亲权鉴定方面已开展了部分研究,主要集中在同工酶生化标记研究上。吴艺等采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对施氏鲟、西伯利亚鲟及其正反杂交种4个群体5种组织(心、肝、肌、眼、肾)的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乙醇脱氢酶(ADH)3种同工酶进行了分析,发现3种同工酶在各自群体内具有明显的组织特异性;在4个不同鲟鱼群体间也表现出明显的规律性差异,可作为区分这4种鲟鱼的生化遗传标记。尹洪滨等同样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对4个群体5个组织进行9种同工酶表达分析发现杂交种的酶带表达比亲本复杂,但多与母本酶带表达相近,并通过聚类分析表明施氏鲟、施氏鲟(♀)×西伯利亚鲟(♂)杂交种聚为同一分支,西伯利亚鲟、西伯利亚鲟(♀)×施氏鲟(♂)杂交种聚为另一分支。采用此类方法进行鉴定,虽然操作简单,易于学习掌握,但是样品制备复杂,样本间产生的条带差异较小,极易受到样品采集方法和实验过程中的各种条件的影响,因此近年在鲟鱼鉴别中报道较少,多用于检测人工饲养条件下的鲟鱼个体健康评估与测定。为了能够更好的对西杂及其亲本西伯利亚鲟和施氏鲟进行鉴定,故急需开发一种快速、稳定、可靠的方法,为后续的研究提供可靠的基础。

本发明中的西杂是指以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交种;施杂是指以施氏鲟为母本西伯利亚鲟为父本杂交种。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题为:如何快速、稳定、可靠地对西伯利亚鲟、施氏鲟及它们的杂交种进行鉴定。

本发明的技术方案为:鉴定施氏鲟、西伯利亚鲟及其杂交后代的引物,它由施氏鲟引物对和微卫星引物对HLJS41构成,其中,施氏鲟引物对的前向引物序列如SEQ ID No.1所示(TGTGGGGTCACGGACTTTACAG),后向引物序列如SEQ ID No.2所示(TATACACCATTATCTCTATGT);微卫星引物对HLJS41的前向引物序列如SEQ ID No.3所示(GCGCCACACACTCAACTCT),后向引物序列如SEQ ID No.4所示(GCGTCCCAATAGACCACATT)。

鉴定施氏鲟、西伯利亚鲟及其杂交后代的引物在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代鉴定上的用途。

一种施氏鲟、西伯利亚鲟及其杂交后代的鉴定方法,包括如下步骤:

(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版,以微卫星引物对HLJS41为引物进行PCR扩增,如果出现255bp的扩增产物而不出现202bp的扩增产物,则为施氏鲟;如果出现202bp的扩增产物而不出现255bp的扩增产物,则为西伯利亚鲟;如果同时出现255bp和202bp的扩增产物,则为西杂或施杂;

(2)对鉴定为西杂或施杂的鲟鱼DNA进行鉴定:以待鉴定的鲟鱼DNA为模版,以施氏鲟引物对为引物进行PCR扩增,如果出现252bp的扩增产物,则为施杂;否则为西杂。

施氏鲟引物对的前向引物序列如SEQ ID No.1所示,后向引物序列如SEQ ID No.2所示;微卫星引物对HLJS41的前向引物序列如SEQ ID No.3所示,后向引物序列如SEQ ID No.4所示。

与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

采用本发明的引物和方法,可以简单快速地可将西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代进行区分。

附图说明

图1施氏鲟引物对扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱;

图2微卫星引物对HLJS41扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

具体实施方式

1.1.材料

1.1实验材料:

亲本样品:西伯利亚鲟34份,施氏鲟10份(取部分鳍条用无水乙醇保存)

子代样品:西杂12尾,施杂12尾(取整体用无水乙醇保存)

1.2实验器材:

PCR仪:Bio-Rad iCycler和MJ100;

离心机:Eppendorf Centrifuge5415D;

稳压稳流电泳仪:Bio-Rad powerPAC300;

凝胶成像系统:Alphalmage Multimage Light Cabinet;

电子天平、恒温水箱、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床、离心机以及一些常用实验设备。

1.3主要药品和试剂:

双蒸水(MilliQ)、二水二胺四乙酸二钠(EDTA-Na.2H2O)、蛋白酶K(Merck公司)(10mg/mL)、Tris碱、浓盐酸、NaOH、MgCl2、Taq酶缓冲液、dNTPs(10mM)等等。

2.方法

2.1总基因组DNA的提取

①切取不多于30mg的组织材料,放入装有200μlGA缓冲液的离心管中(离心管做好标记),涡旋振荡15sec。

②加入20μl Proteinase K(20mg/ml)溶液,涡旋混匀,简短离心以去除管盖内壁的水珠,在56℃放置(消化),直至组织完全溶解,简短离心以去除管盖内壁的水珠,再进行下一步骤。

③加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。(注意:在等待时应放入4℃的冰箱中)

④加入200μl无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中,并做好标记),12000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。

⑥向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入600μl缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。

⑧重复步骤7。

⑨将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置数分钟(大概10min),以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验)

⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μl洗脱缓冲液TE(本实验用ddH2O),室温放置2~5min,12000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。

2.2琼脂糖凝胶电泳检测DNA

①制备1%琼脂糖凝胶:用天平称取0.4~0.6g琼脂糖,倒入45mL左右的1倍TAE缓冲液,摇匀后置于微波炉中高温加热至完全溶解,取出待稍凉后,加入EB 2uL。

②胶板制备:将制胶板放置于水平位置,然后插入样品梳子。将上一步制得的琼脂糖凝胶液倒入制胶板槽内。冷却半小时待凝胶固定后轻轻拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内。加入TAE液使其浸没凝胶。

③加样:在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液(溴酚蓝),后用枪吸2uL DNA溶液加入点样缓冲液并混匀,记录点样顺序和点样量。

④跑电泳:100V电压,400mA电流,电泳15~20min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳的亮度来确定模板DNA的浓度,若浓度高,可以加适量MilliQ(ddH2O)稀释,若浓度低可在PCR扩增时适量增加加入量。检测后的DNA置于-20℃冰箱保存备用。

2.3引物设计

根据鲟鱼线粒体序列及微卫星序列,设计了两对引物,分别命名为施氏鲟引物对和微卫星引物对HLJS41,引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG(SEQ ID No.1所示)

施氏鲟引物对的后向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG(SEQ ID No.2所示)

微卫星引物对HLJS41的前向引物序列为GCGCCACACACTCAACTCT(SEQ ID No.3所示)

微卫星引物对HLJS41的后向引物序列为GCGTCCCAATAGACCACATT(SEQ ID No.4所示)

2.4PCR扩增体系及条件

施氏鲟引物对PCR扩增:PCR反应体系合计25μL(模板1μL、Mix 12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL)。PCR反应条件如下:95℃预变性5min;然后循环35次,每一个循环包括94℃变性40s,55℃退火35s,72℃延伸50s;最后72℃下延伸10min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后,用紫外线检测扩增后的片段。

微卫星引物对HLJS41PCR扩增:PCR反应体系合计25μL(模板1μL、Mix 12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL)。PCR反应条件如下:95℃预变性5min;然后循环35次,每一个循环包括94℃变性40s,55℃退火35s,72℃延伸50s;最后72℃下延伸10min。PCR反应产物使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel,简称PAAG)电泳检测,电泳结束后使用改良银染法进行染色-显影-扫描成像后保存数据结果。

3.结果

施氏鲟引物对在以施氏鲟及以施氏鲟为母本的杂交后代DNA为模版的PCR扩增中出现长度252bp特异性条带,而在以西伯利亚鲟为母本的杂交后代DNA为模版的PCR扩增中并未出现特异性条带(图1)。

微卫星引物对HLJS41在以施氏鲟DNA为模版的PCR扩增中出现255bp的条带,在以西伯利亚鲟DNA为模版的PCR扩增中202bp的条带,而在以其杂交种质DNA为模版的PCR扩增中出现255bp和202bp的杂合条带(图2)。

4结果分析

根据上述结果可见,以待鉴定的鲟鱼DNA为模版,以微卫星引物对HLJS41为引物进行PCR扩增,如果出现255bp的扩增产物而不出现202bp的扩增产物,则为施氏鲟;如果出现202bp的扩增产物而不出现255bp的扩增产物,则为西伯利亚鲟;如果同时出现255bp和202bp的扩增产物,则为西杂或施杂;对鉴定为西杂或施杂的鲟鱼DNA进行进一步地鉴定:以待鉴定的鲟鱼DNA为模版,以施氏鲟引物对为引物进行PCR扩增,如果出现252bp的扩增产物,则为施杂;否则为西杂。

实施例

以待鉴定的鲟鱼DNA为模版(提取方法采用前面2总基因组DNA的提取方法),以微卫星引物对HLJS41为引物进行PCR扩增,PCR反应体系合计25μL(模板1μL、Mix12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL)。PCR反应条件如下:95℃预变性5min;然后循环35次,每一个循环包括94℃变性40s,55℃退火35s,72℃延伸50s;最后72℃下延伸10min。PCR反应产物使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel,简称PAAG)电泳检测,电泳结束后使用改良银染法进行染色-显影-扫描成像后保存数据结果。如果出现255bp的扩增产物而不出现202bp的扩增产物,则为施氏鲟;如果出现202bp的扩增产物而不出现255bp的扩增产物,则为西伯利亚鲟;如果同时出现255bp和202bp的扩增产物,则为西杂或施杂;

对鉴定为西杂或施杂的鲟鱼DNA进行进一步地鉴定:以待鉴定的鲟鱼DNA为模版,以施氏鲟引物对为引物进行PCR扩增,PCR反应体系合计25μL(模板1μL、Mix 12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL)。PCR反应条件如下:95℃预变性5min;然后循环35次,每一个循环包括94℃变性40s,55℃退火35s,72℃延伸50s;最后72℃下延伸10min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后,用紫外线检测扩增后的片段。如果出现252bp的扩增产物,则为施杂;否则为西杂。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请技术方案构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1