本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测无乳链球菌的引物、探针及检测方法。
背景技术：
：无乳链球菌又称为b组溶血性链球菌，是革兰氏阳性菌，成对或呈短链状排布。无乳链球菌一直是新生儿和女性生殖道感染的重要病原菌，特别是其引发的新生儿脑膜炎和败血症，严重威胁新生儿生命安全。同时国标gb4789.11-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验》规定了对食品中无乳链球菌的检测。因此，开发无乳链球菌的快速检测方法有着重要的现实意义。目前无乳的检测方法传统培养方法，免疫学方法以及pcr方法。虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，成本低廉，但是检测的周期较长，检测效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。而免疫学检测方法存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易发生交叉反应。pcr检测方法的不足之处在于需要昂贵的温控仪器，检测时间相对较长。这些方法均不符合现场快速检测的要求。重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinasepolymeraseamplification,rpa)是2006年提出的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到dna双链模板的同源靶序列上，并在单链dna结合蛋白的协助下，解链模板dna，随后在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前rpa技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有被应用于无乳链球菌的检测应用中。技术实现要素：为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于检测无乳链球菌的rpa引物，其引物序列如下针对sip基因：上游引物seqidno.1：5’-caccggtaagaactgtagcagcccctagagtg-3’下游引物seqidno.2：5’-cttcagtcgcttgtaacttactgtctgtagc-3’。优选的，采用上游引物、下游引物中的至少一种，或选自该引物碱基序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。优选的，所述下游引物seqidno.2在5’端进行biotin修饰。本发明还提供一种用于检测无乳链球菌的rpa探针，其序列如下：sip基因的探针：5’-aagtagaaactggtgcatcaccagagcatgtatcagctccagcag-3’。其长度为45-52bp，探针的5’端30bp的位置处采用dspacer修饰，dspacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团rox和淬灭基团bhq1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团c3spacer修饰。优选的，所述探针采用探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。本发明提供一种检测无乳链球菌的rpa方法，包括如下几个步骤：(1)提取待测样品的dna；(2)采用rpa特异性引物、rpa特异性探针、提取dna以及反映buffer、醋酸镁配置成反应体系；(3)在rpa反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光，判断待测基因组是否为无乳链球菌。优选的，rpa反应体系以50μl计为：dna模板2μl10umol/l上、下游引物各2.1μl10umol/l探针0.6μl1×反应缓冲液29.5μl280mmol/lmg+缓冲液2.5μlddh2o11.2μl。优选的，所述rpa反应条件为：37℃-42℃，反应时间为15-20分钟。优选的，所述rpa反应体系进一步包括阳性质控品和阴性质控品。所述的方法在检测无乳链球菌中实现了良好的应用。本发明的有益效果包括：(1)本发明将rpa技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测无乳链球菌。(2)本发明特异性强，灵敏度高，可在恒温37-42℃下进行反应，大大减少了对于昂贵温控设备的要求，且在20min内完成反应，可以快速的对无乳链球菌进行检测，具有较高实用价值。附图说明图1为rpa方法的建立。图2为rpa方法对链球菌属特异性实验。图3为rpa方法对常见致病菌特异性验证实验。图4为rpa灵敏度实验,曲线代表以不同浓度菌液提取的dna作为实验的模板。具体实施方式下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：实施例1靶基因的选取与rpa引物探针的设计及筛选利用生物信息学知识以及相关分析软件，对无乳链球菌常见的毒力基因进行分析，诸如cfb、sip、cyle等，通过对无乳链球菌的这些基因与其他微生物进行比对分析，将sip作为待选靶基因，并选择特异性较高的序列片段。根据rpa对引物和探针的设计要求，设计特异性引物及探针，之后再次将引物与探针的序列与无乳链球菌同源性高的物种进行比对，从中选择特异性高的引物及探针。之后对待选引物及探针进行试验比较分析，从中选择特异性高，扩增效率高的一个组合。筛选得到的引物及探针序列分别如所示(seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3)。其中探针需要被修饰，在探针中间距5’端31bp的位置处采用dspacer修饰，dspacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团rox和淬灭基团bhq1取代，并且在探针的3’末端也需要同过阻塞基团c3spacer修饰。上游引物seqidno.1：5’-caccggtaagaactgtagcagcccctagagtg-3’下游引物seqidno.2：5’-cttcagtcgcttgtaacttactgtctgtagc-3’。探针seqidno.3：5’-aagtagaaactggtgcatcaccagagcatgtatcagctccagcag-3’。引物及探针交由上海生物工程有限公司合成。实施例2无乳链球菌rpa方法的建立将无乳链球菌atcc13813接种到脑心浸出液(bhi)肉汤中，放置在摇床上，37度下培养过夜，吸取1ml培养菌液滴加到1.5ml离心管内，12000g离心2min，弃去上清液，加入500μl无菌生理盐水，充分悬浮混匀，12000g离心2min，弃上清，重复添加无菌生理盐水，再离心，弃上清。添加50μl生理盐水，100℃水浴10-15min，待冷却室温12000g离心2min，上清液于-20℃保存备用。以无乳链球菌atcc13813的dna作为模板，同时设置空白对照，利用实施例1中的rpa引物及探针进行rpa扩增，并利用荧光收集装置收集荧光，结果图1所示。rpa扩增体系如下：向含有冻干酶粉的rpa反应管中加入再水化缓冲液29.5μl、去离子水11.2μl、上下游引物各2.1μl、探针0.6μl、模板2μl、最后再加入醋酸镁溶液2.5μl。rpa的反应条件：将上述rpa反应体系充分混匀，在37℃条件下，扩增20min。实施例3对所建立的rpa方法进行特异性试验分析本实施例中采用的标准菌株均有广州环凯微生物有限公司代为购买，具体信息如表1所示。表1用于rpa特异性分析的菌株以表1中菌株dna作为rpa反应模板，利用实施例1中的rpa引物及探针进行rpa扩增。rpa扩增体系如下：向含有冻干酶粉的rpa反应管中加入再水化缓冲液29.5μl、去离子水11.2μl、上下游引物各2.1μl、探针0.6μl、模板2μl、最后再加入醋酸镁溶液2.5μl。rpa的反应条件：将上述rpa反应体系充分混匀，在37℃条件下，扩增20min。扩增结果如图2和图3所示，从结果中可以知道，只有阳性对照无乳链球菌atcc13813的扩增结果呈阳性，链球菌属的其他菌以及其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。该结果表明，本发明rpa引物、rpa探针以及rpa方法的特异性良好。实施例4利用rpa引物及探针检测无乳链球菌的灵敏度分析以无乳链球菌atcc13813为模板，利用实施例1中的rpa引物及探针进行扩增，其中不同反应中，dna的总含量分别相当于6×106cfu/reaction,、6×105cfu/reaction、6×104cfu/reaction、6×103cfu/reaction、6×102cfu/reaction。rpa扩增体系如下：向含有冻干酶粉的rpa反应管中加入再水化缓冲液29.5μl、去离子水11.2μl、上下游引物各2.1μl、探针0.6μl、模板2μl、最后再加入醋酸镁溶液2.5μl。rpa的反应条件：将上述rpa反应体系充分混匀，在37℃条件下，扩增20min。灵敏度的实验结果如图4所示，由结果可知，本发明rpa法的检测下限可以达到6000cfu/reaction。说明本发明的灵敏度高，适用性强。与现有的检测无乳链球菌的技术相比，本发明可在恒温37℃下进行反应，大大减少了对于温控设备的要求；在20min内完成反应，可以快速的对无乳链球菌进行检测；特异性强，灵敏性高。本发明为食品安全或者临床诊断提供了一种简便快捷的技术手段，具有较高实用价值。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。序列表<110>深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站，国家数字电子产品质量监督检验中心）<120>用于检测无乳链球菌的rpa引物、探针及检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggaatgtcatacttagcgggtttgacacgagc32<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggtggtatttgacgctggcggtgcaaacct30<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgctgaagaatgagaagttccccaaaatgtggaaacattaaatc44当前第1页12