本发明涉及一种检测hras基因突变的检测产品，属于生物
技术领域：
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背景技术：
hras是ras基因家族中的一员，ras主要为活化控制基因转录的激酶，从而调节细胞的增生与分化。ras基因的点突变通常导致癌细胞的过度活化，使得细胞不正常增生与转移。在ras基因族，在人体肿瘤中已从膀胱、小细胞肺癌(ha-ras，kit-ras),胃(n-ras),乳腺(ha-ras)等证明在12或61号编码子出现点突变所导致一个氨基酸的置换。突变(一个氨基酸置换)可使其编码产物蛋白p21的gtpase活性明显下降，从而影响p21的生物学活性。h-ras基因定位于11号染色体，由946个腺嘌呤、2287个胞嘧啶、2113个鸟嘌呤、1107个胸腺嘧啶组成。研究表明，h-ras能诱导人乳腺上皮细胞产生浸润表型，n-ras则不能。这表明h-ras在乳腺癌发生中起更重要的作用。同时h-ras癌基因点突变与膀胱癌密切相关，h-ras在原发性膀胱癌中的突变率为6％-76％，其中密码子12是发生突变的热点位置，突变激活了h-ras基因的恶性转化能力，从而引起细胞癌变，检测该点突变对膀胱癌的诊断、愈后及监测都具有重要的临床价值。外周血细胞游离dna是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfdna较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dpcr)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字pcr由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的arms方法相比，数字pcr在检测血浆cfdna时灵敏度明显优于arms法。pna(peptidenucleicacid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成dna类似物，它与dna分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与dna一致。基于pna的数字pcr技术主要依赖pna探针的两个重要特性：第一，pna只能与完全配对的互补dna链杂交，只要有单一碱基发生错配，pna就不能与互补的dna链结合；第二，pna寡聚体不能被dna聚合酶识别，从而不会成为pcr扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的pcr扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，dna/pna双链结合松动，dna寡聚体模板链就可以正常延伸，作为pcr引物，使发生突变的样本在数字pcr中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高，最终模板dna需求量少，可以快速便捷地进行精准定量pcr检测的hras基因突变检测检测体系及其试剂盒。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测hras基因突变的检测体系，包括数字pcr预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第12密码子g12v位点的上游引物、下游引物肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与hras突变型基因第12密码子g12v位点完全互补且核苷酸序列如seqidno.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字pcr预混液中包括dna聚合酶、超纯水、dntps混合液、液滴稳定剂和缓冲液。所述肽核酸探针的5’端设有报告荧光基团fam，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团bhq。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μm/l；所述肽核酸探针在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μm/l。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的检测hras基因突变检测产品。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测hras基因突变的试剂盒，包括数字pcr预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控；所述引物探针混合液包括用于检测第12密码子g12v位点的上游引物、下游引物肽核酸探针；所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述肽核酸探针的核苷酸序列与hras突变型基因第12密码子g12v位点完全互补且核苷酸序列如seqidno.3所示；所述肽核酸探针核苷酸序列的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字pcr预混液包括dna聚合酶、超纯水、dntps混合液、液滴稳定剂和缓冲液；所述阳性质控是含突变型hras基因标准质粒溶液；所述阴性质控是含野生型hras基因标准质粒溶液。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μm/l；所述肽核酸探针b在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μm/l；所述肽核酸探针的5’端设有报告荧光基团fam，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团bhq。所述上游引物和下游引物在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l；所述肽核酸探针在反应体系中的最终浓度分别为0.21μm/l。所述数字pcr预混液包括浓度为1u/μl的热启动taq酶和udg酶、浓度为4mm的mgcl2、浓度为50mm的ph值为8.3的tris-hcl、浓度为300mm的dntp、浓度为1.6μl/反应的液滴稳定剂。反应时，40体积的反应体系包括数字pcr预混液10体积，引物探针混合液10体积，模板1体积，灭菌超纯水19体积，所述模板的使用浓度为10ng/μl～100ng/μl。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是一种精准定量检测hras基因突变的检测方法，采用上述精准定量检测hras基因突变的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：(1)提取样本dna：外周血全血1900×g离心后吸取血浆，1120×g再次离心，吸取上清液，使用qiampcirculatingnucleicacidkid(德国qiagen公司)抽提cfdna。获得pcr扩增dna模板；(2)配制数字pcr反应液：向步骤(1)处理后得到的dna模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字pcr预混液、引物探针混合液，配制得到样本的数字pcr反应液；(3)将步骤(2)制备的数字pcr反应液制作为油包水pcr微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10000～20000个；然后对所述微反应液滴进行pcr扩增反应；其中，数字pcr扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，64℃退火15秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃再延伸10分钟，4℃停止反应；(4)读取荧光信号：步骤(3)pcr扩增后，将pcr反应板放入荧光读取仪器中，在fam通道中进行基因型检测，通过仪器配套quantasoft软件进行定量分析，计算出hras突变基因的拷贝数。本发明具有积极的效果：1)本发明的hras基因突变检测试剂盒与常规探针设计原则不同，本发明的数字pcr技术依赖于肽核酸探针pna，只能与完全配对的突变型互补dna链杂交，只要有单一碱基发生错配，pna就不能与互补的dna链结合，达到探针和靶序列特异性结合的目的，对检测体系优化，仅需单一探针即可实现特异性检测，大大降低检测成本，满足大样本量临床筛查的要求。将数字pcr与肽核酸探针相结合，可实现其在肿瘤早期诊断、治疗评估、复发监测领域的应用。2)肽核酸pna的5’端连接有4个氨基酸，它们形成了带有n4结构的新型强螯合基团，该基团的存在可以为肽核酸与模板dna的结合消除空间阻碍，经过该基团的修饰，pna同模板dna的结合效率比未修饰的提高了1～2倍，最终模板dna需求量少，极大的提高了检测的灵敏度。3)本发明基于数字pcr平台，对hras突变基因进行绝对定量检测，不依赖于扩增曲线的阈值(ct)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现hras突变基因的绝对精准定量分析。4)本发明在hras突变基因含量极低的样本检测中，对检测样本溶液采用微滴化处理，数字pcr检测系统通过微滴化处理，可以大大减少背景和基质的干扰，使得本发明的灵敏度为0.01％，特异性为100％，能够对更低突变丰度的样本进行检测。5)本发明提供的方法和试剂盒可以在具有数字pcr的实验室完成，检测时间仅需要3小时，结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点。附图说明图1是采用实施例的试剂盒检测阴性质控的hras基因野生型样本的荧光检测结果图。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性质控的hras基因突变型样本的荧光检测结果图。图3是应用修饰的肽核酸探针的灵敏度分析结果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。一、试剂盒的组成。本实施例的hras基因突变检测试剂盒，包括数字pcr预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表成分分装试剂公司数字pcr预混液1管lifetechnologies引物探针混合液1管——阳性质控1管上海百力格生物技术有限公司阴性质控1管上海百力格生物技术有限公司上述表1中试剂盒组分的说明如下：1)数字pcr预混液的主要成分包括dna聚合酶、超纯水、dntps混合液、液滴稳定剂和缓冲液(由lifetechnologies公司提供，货号：1508099)等。所述液滴稳定剂的主要成分是矿物油(由raindancetechnologies公司提供，货号：30-00826)，主要作用是微滴化处理过程将反应体系形成油包水小液滴。2)引物探针混合液包括用于检测hras基因第12密码子g12v位点的上下游引物和肽核酸探针。本实施例采用肽核酸探针，其序列与突变型hras基因第12密码子g12v位点序列完全互补配对。肽核酸探针为双标记的探针，探针的5’端连接有4个氨基酸[glu-(asp)-ala-glu-glu]，即，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸(其中第一个谷氨酸由天冬氨酸代替也可满足要求)，形成n4结构，该螯合基团能在空间上消除dna链之间的相互影响，增强模板与探针的结合效率，提高灵敏度。在肽核酸的末端设有报告荧光基团fam，探针的3’端设有淬灭荧光基团bhq。如果引物和探针的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低pcr检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而，必须对扩增序列有充分的了解，并规范pcr实验室操作技术，针对野生和突变使用相同的上游引物和下游引物，防止由于引物过多相互干扰，降低检测的灵敏度。当检测模板(dna模板)发生突变时，相应的检测探针有fam荧光信号。3)阳性质控是浓度为100copies/μl的含突变型hras基因标准质粒溶液；4)阴性质控是浓度为100copies/μl的含野生型hras基因标准质粒溶液。二、引物探针设计。由于肿瘤游离dna的长度很短，长度≤180bp，血液中正常细胞的裂解会释放大量的dna，进一步降低ctdna的丰度。核酸酶也会影响血液中ctdna的稳定性，使得部分目标片段序列可能会更短，因此扩增用的引物、探针序列不能过长。肽核酸探针一般是指特定序列的13～18个碱基的短肽核酸，其长度比dna探针更短，碱基配对的特异性也明显提高，能够通过单碱基错配来分辨不同的核酸序列，杂交条件也比dna探针温和，低盐浓度下不影响杂交。本发明设计的引物长度为14～18bp，肽核酸探针长度为13～18bp，产物长度50～80bp，如表2所示。表2引物探针序列表位置检测类别seqno.sequence(5’—3’)12密码子上游引物1tataagctggtggtg12密码子下游引物2tagtggggtcgtatg12v位点肽核酸探针3ggtgggcgccgtc引物由上海百力格生物技术有限公司合成，肽核酸探针由北京思尔成生物技术有限公司合成，按照引物说明书由干粉稀释成工作母液，再由母液配置成检测工作液，引物和探针混合液均由母液加入灭菌超纯水稀释而成。为满足数字pcr高灵敏的体系需求，优化反应体系，用于检测第12密码子g12v位点的上下游引物a在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μm/l，优选的最终反应浓度为0.19μm/l；肽核酸探针b在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μm/l，优选的最终反应浓度分别为0.21μm/l。三试剂盒的使用方法。1、样本dna提取dna来源可以是血清/血浆、血浆、外周血等。用德国qiagen公司提供的血清/血浆总dna提取试剂盒(货号：55114)，按照试剂盒操作说明书抽提患者血清/血浆中的游离dna。获得血清/血浆样本游离dna后，通过thermo-fisher公司3.0核酸蛋白荧光定量仪，测定血清/血浆样本游离dna浓度和纯度，-20℃保存。2、数字pcr反应液制备根据表3中的pcr反应体系，取试剂盒中数字pcr预混液10μl，引物探针混合液10μl，模板1μl，灭菌超纯水19μl，制得数字pcr反应液，配制定量反应体系，振荡混匀，离心除气泡。模板是指血清/血浆样本稀释后的样本dna、阳性质控和阴性质控。表3pcr反应体系表反应成分加入体积数字pcr预混液10μl引物探针混合液10μl模板1μlddh2oto40μl3、pcr反应微滴制备将步骤2配制好的相应数字pcr反应液，用raindance公司生产的微滴生成器raindropsource对样本进行微滴化处理，按照仪器使用说明进行操作，实现对反应体系的分液处理，将制备好的相应pcr微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。4、pcr扩增将步骤3装有相应pcr微反应液滴的96孔pcr板放入pcr仪，反应程序如下：预变性阶段的条件95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，64℃退火15秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃再延伸10分钟，4℃停止反应。5、微滴检测pcr反应结束后，将pcr反应板置于微滴分析仪中，数据分析使用raindropanalyst10.0.7r2完成，具体步骤：(1)杂音的排除。杂音的存在会严重干扰最后计数的结果，导致假阳性的发生。利用软件中自带的功能“event&对应通道”来判断该坐标轴中散点的性质：如果散点聚成一团出现，则提示为杂音；如果为均匀分布，则提示为阳性液滴，计数有效。(2)荧光补偿。每个液滴均不可避免存在荧光交叉的情况，具体表现为vic通道中可以检测到部分fam荧光信号，反之也是如此，荧光补偿仅能改变“簇”的位置，不改变“簇”的相对位置和其中所含散点的数量。(3)设门和定值。在多重体系中加入对应质粒获得的散点分布图可用于设定“门”，“门”是一个标准化的概念，其大小和位置是固定的，“门”所包含的散点的集合即为“簇”，散点的个数对应为液滴数，减去空白检测限(limitofblank，lob)即为目的片段的拷贝数。(4)结果解读。在fam通道收集fam荧光信号，根据荧光微滴数量，通过quantasoft软件对各自通道样品进行定量。野生型样品通过fam通道检测，无信号，反应微滴数为0，计算出来的拷贝数为0，则野生型样品定量结果为0copies/μl，如图1所示。hras突变型样品，在fam通道中能够检测到荧光信号，软件计算拷贝数为10～100copies/μl，如图2所示。四、数字pcr中修饰后的肽核酸探针与普通肽核酸探针灵敏度分析比对。将连续梯度倍比稀释好的阳性标准品分别利用肽核酸探针与普通肽核酸探针组成的两种数字pcr反应体系进行检测，数字pcr反应体系为：数字pcr预混液10体积，引物探针混合液10体积，模板1体积，灭菌超纯水19体积。具体检测方法包括如下步骤：(1)提取样本dna：外周血全血1900×g离心后吸取血浆，1120×g再次离心，吸取上清液，使用qiampcirculatingnucleicacidkid(德国qiagen公司)抽提cfdna。获得pcr扩增dna模板；(2)配制数字pcr反应液：向步骤(1)处理后得到的dna模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字pcr预混液、引物探针混合液，配制得到样本的数字pcr反应液；(3)将步骤(2)制备的数字pcr反应液制作为油包水pcr微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10000～20000个；然后对所述微反应液滴进行pcr扩增反应；其中，数字pcr扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，64℃退火15秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃再延伸10分钟，4℃停止反应；(4)读取荧光信号：步骤(3)pcr扩增后，将pcr反应板放入荧光读取仪器中，在fam通道中进行基因型检测，通过仪器配套quantasoft软件进行定量分析，计算出hras突变基因的拷贝数。图3中从左至右前8列为利用修饰的肽核酸探针检测结果，阳性质粒浓度依次为50copies/μl、20copies/μl、5copies/μl、4copies/μl、2copies/μl、100copies/μl、3copies/μl、阴性。图中从左至右第9列到16列为普通肽核酸探针检测结果，阳性质粒浓度依次为100copies/μl、50copies/μl、20copies/μl、4copies/μl、3copies/μl、2copies/μl、5copies/μl、阴性。结果如图3所示，利用普通肽核酸探针进行数字pcr反应，对连续梯度倍的阳性质粒进行10次检测，发现当质粒最低浓度为5copies/μl时有扩增，质粒浓度浓度低于5copies/μl时没有扩增，因此推断利用普通肽核酸探针的最低检测拷贝数为5copies/μl。利用经修饰后的肽核酸探针进行数字pcr反应，发现阳性质粒可检测至2copies/μl，计算得到利用修饰后的肽核酸探针进行数字pcr反应是未修饰肽核酸探针最低检测限的2.5倍。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。序列表<110>上海赛安生物医药科技股份有限公司<120>检测hras基因突变的检测体系及其试剂盒<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>15<212>dna<213>人工序列(无)<400>1tataagctggtggtg15<210>2<211>14<212>dna<213>人工序列(无)<400>2tagtggggtcgtat14<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列(无)<400>3ggtgggcgccgtc13当前第1页12