一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法与流程

文档序号:15457623发布日期:2018-09-15 01:34

本发明属于生物医药领域,具体涉及一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法。



背景技术:

目前重组融合类生物制品一般是以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达载体,CHO细胞内本身可能存在内源性逆转录病毒,如异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV)。虽然该病毒对人类不具有致病性,但仍有潜在的风险。现国内对于X-MuLV检测的研究报道较少,目前检测X-MuLV的方法主要有病毒感染性试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应法(PCR)等方法。病毒感染性试验存在检测周期长且步骤繁琐等缺陷;ELISA方法容易导致假阴性且成本高;PCR技术由于具有较高的灵敏度和特异性,对工作人员的要求低,费用低,能广泛普及。



技术实现要素:

本发明的一个目的是提供一种能够快速、灵敏检测生物制品中的X-MuLV的特异性引物。

本发明的另一个目的是提供一种能够快速、灵敏检测生物制品中的X-MuLV的检测方法。

为解决以上技术问题,本发明采用如下技术方案:

本发明的一个目的是提供一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物,所述的特异性引物包括逆向引物,所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’。

优选地,所述的特异性引物还包括正向引物,所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’。

本发明的另一个目的是提供一种异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法,包括如下步骤:

(1)根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物,所述的特异性引物包括正向引物和逆向引物,所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’, 所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’;

(2)提取生物制品中的总RNA;

(3)根据步骤(1)设计逆向引物和步骤(2)提取的总RNA进行逆转录;

(4)以步骤(3)得到的逆转录产物为模板,以步骤(1)设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增;

(5)取步骤(4)得到的扩增产物进行凝胶电泳获得检测结果。

优选地,所述的生物制品为重组融合类生物制品、单克隆抗体或生物组织提取制品。

优选地,步骤(4)中进行所述的PCR扩增的扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃总延伸10min;4℃保存。

优选地,所述的扩增产物的长度为345bp。

优选地,所述的凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。

本发明中总RNA的提取、逆转录的进行以及PCR的扩增体系等均采用本领域的常规方法。

由于以上技术方案的实施,本发明与现有技术相比具有如下优势:

本发明能够快速实时检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒,耗时约3小时,而传统的细胞感染试验需耗时5~7天,因此,本发明的检测效果明显提高。

附图说明

附图1为检测结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点,而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1

X-MuLV病毒液中检测X-MuLV病毒的检测方法,包括如下步骤:

(1)根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物,特异性引物包括正向引物和逆向引物,正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’(SEQ ID NO.1),逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ (SEQ ID NO.2);

(2)提取X-MuLV病毒液中的总RNA;

(3)根据步骤(1)设计逆向引物和步骤(2)提取的总RNA进行逆转录;

(4)以步骤(3)得到的逆转录产物为模板,以步骤(1)设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增;扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃总延伸10min;4℃保存;

(5)取步骤(4)得到的扩增产物进行1%凝胶电泳(120V,30min)获得检测结果,结果见图1。

实施例2

尼妥珠单抗制品中检测X-MuLV病毒的检测方法,包括如下步骤:

(1)根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物,特异性引物包括正向引物和逆向引物,正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’(SEQ ID NO.1),逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ (SEQ ID NO.2);

(2)提取尼妥珠单抗制品中的总RNA;

(3)根据步骤(1)设计逆向引物和步骤(2)提取的总RNA进行逆转录;

(4)以步骤(3)得到的逆转录产物为模板,以步骤(1)设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增;扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃总延伸10min;4℃保存;

(5)取步骤(4)得到的扩增产物进行1%凝胶电泳(120V,30min)获得检测结果,结果见图1。

对比例1

MuLV病毒液中检测X-MuLV病毒的检测方法,包括如下步骤:

(1)根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物,特异性引物包括正向引物和逆向引物,正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’(SEQ ID NO.1),逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ (SEQ ID NO.2);

(2)提取MuLV病毒液的总RNA;

(3)根据步骤(1)设计逆向引物和步骤(2)提取的总RNA进行逆转录;

(4)以步骤(3)得到的逆转录产物为模板,以步骤(1)设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增;扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃总延伸10min;4℃保存;

(5)取步骤(4)得到的扩增产物进行1%凝胶电泳(120V,30min)获得检测结果,结果见图1。

图1中M代表Marker,1为实施例1的扩增产物的检测结果,2为实施例2的扩增产物的检测结果,3为对比例1的扩增产物的检测结果,N为无模板的阴性对照。从图1可见,实施例1和实施例2在345bp处出现明显的条带,而对比例1无条带出现,由此可见,本发明能够很好的检测生物制品中是否存在X-MuLV病毒。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州良辰生物医药科技有限公司

<120> 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

gacaggacaa acagctaacg c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

cactggagac cgaggaatca t 21

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