miRNA在制备高级浆液性上皮性卵巢癌化疗耐药性评价试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域；更具体地，涉及microrna在制备预测高级别浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的试剂盒中的应用，为临床上卵巢癌患者对铂类药物化疗敏感性及无进展生存提供辅助诊断。

背景技术：

上皮性卵巢癌(以下简称卵巢癌)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其病死率在所有妇科肿瘤中最高，5年生存率长期徘徊在30～40％，我国卵巢癌发病率虽位于女性肿瘤第三位，病死率却位于首位。上皮性卵巢癌的标准治疗是手术和以铂类-紫杉醇为基础的联合化疗。然而，即使在达到完全反应的患者中，复发的风险也很高，并且大多数患者发展为铂耐药。患者长期预后仍然很差，特别是高级浆液性上皮性卵巢癌(hgsoc)。

hgsoc具有高度异质性，传统的预后特征如患者年龄，分期，组织学分级和肿瘤残余大小对化疗反应性及预后的预测价值有限。随着研究的进展，大规模rna表达谱已被用于筛选与卵巢癌化疗和预后相关的分子标志物。然而，mrna表达检测通常需要新鲜或冷冻的组织，其必须被显微切割以除去可能减弱肿瘤的基因表达标志的相关非肿瘤组织。此外，mrna表达并不总是与蛋白质水平相关。在临床应用中，免疫组织化学(ihc)仍然是评估肿瘤细胞或基质细胞中蛋白质丰度的最广泛的手段，因为它只需要石蜡包埋(ffpe)肿瘤组织，并且很容易储藏。许多研究报道了ihc标记物对卵巢癌预后的评估，但没有得到一致的结果。

近年来，关于非编码rna(ncrna)在肿瘤中的作用的研究取得长足进步。其中，microrna(mirna)因其在基因表达调控中的重要作用而被广泛研究。mirna是一种21-25个核苷酸组成的短核酸序列，主要通过抑制翻译和诱导转录产物降解起到基因表达调控的作用。mirna的发夹环三级结构可以抵抗降解，从而稳定的存在于细胞核、细胞浆甚至脱离细胞游离于循环系统中。尽管mirna在卵巢癌恶性生物学表型中的作用以及与卵巢癌患者预后相关性的研究已有发表，但是mirna作为卵巢癌复发进展和耐药的预测模型很少，而经过大样本量验证的则更少。

近期，bagnoli及其同事报道了一项多中心研究，检测上皮性卵巢癌中的mirna表达，目的是鉴定与复发进展相关的分子特征。该研究以随机临床试验的179个样本作为训练集(oc179)，以两个肿瘤中心的263个样本(oc263)以及癌症基因组图谱(tcga)数据集的452个样本(oc452)作为验证集，分析了初治卵巢癌患者多聚甲醛固定石蜡包埋(ffpe)和新鲜冷冻(ff)样品中mirna表达。研究构建了35个mirnas的预测模型(mirovar)，显著区分了低风险和高风险的复发患者。观察到的低风险和高风险组之间中位无进展生存期(pfs)差异为20个月。该研究是解决mirna作为预后生物标志物在上皮性卵巢癌中的作用的重要一步。但是该研究也有一定局限性。第一，预测模型构建过程中，选取了三个数据集共有的385个mirna，然后通过回归方程挑选出35个和预后相关的mirna作为分子特征。目前已知的和新发现的mirna超过2000种，这样人为缩减了可能和预后相关的mirna数量。第二，研究选取的标本有ffpe和ff，并选用了3中平台检测mirna，加大了batcheffect。第三，研究中声称预测模型独立于组织学特征具有预后意义，虽然tcga数据集是以高级别浆液性卵巢癌为特征，但是在oc179和oc263数据集中样本的组织学特征及分期明显不同。第四，在oc179和oc263中早期卵巢癌患者(figo，i-ii)比例明显高于tcga数据集。此外，oc179和oc263中预测模型定义的低危组早期患者的比例要高于高危组。同时，oc179和oc263中高危组和低危组的中位pfs差异分别是20个月和22个月，而tcga的差异是4个月。综上，卵巢癌患者分期可能影响了预测模型的鉴别能力。第五，虽然预测模型能够显著区分高危组和低危组，但是评判预测模型鉴别能力的roc曲线的auc在tcga数据集中只有0.58±0.02。这种水平的鉴别能力还不足以指导临床决策。

针对上述问题，申请人我们选取了349例高级别上皮性浆液性卵巢癌(hgsoc)患者的ffpe标本，构建并验证了基于6个mirna的hgsoc复发及铂类化疗耐药的预测模型，以及mirna对hgsoc复发进展的预测，填补了hgsoc铂类化疗耐药预测模型的空白，对临床指导hgsoc化疗有巨大帮助。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供microrna在制备预测高级浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的试剂盒中的应用。

在本发明的一方面，提供了一种用于对hgsoc耐药性进行预测的方法，所述的方法为lassocox回归模型。

在本发明的另一方面，提供一组特定mirna的用途，所述的一组特定mirna包括mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96；用于制备预测高级浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的诊断试剂。

在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：特异性扩增mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的引物。

在本发明的另一方面，提供特异性检测mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的试剂的用途，用于制备预测高级浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的试剂盒。

在一个优选例中，所述的特异性检测mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的试剂包括特异性扩增mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的引物。

在本发明的另一方面，提供一种用于预测高级浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的试剂盒。

在一个优选例中，所述试剂盒中包括特异性扩增mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的引物，并且，还包括：

总rna提取试剂；

逆转录试剂；

mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96逆转录引物；

mirna的pcr检测试剂；

mirna核酸扩增引物；

阴性质控品；和/或

阳性质控品。

在本发明的另一方面，提供一种检测高级浆液性上皮性卵巢癌铂类化疗耐药性的方法，所述方法包括：应用所述的试剂盒检测受试者多聚甲醛固定石蜡包埋组织切片样本中mir-1287，mir-3131，mir-335mir-4419，mir-4468，mir-96的存在量；较佳地，该方法包括：

(1)提取受试者多聚甲醛固定石蜡包埋组织切片样本的总rna；

(2)利用mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96逆转录引物进行逆转录，获得mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的cdna；

(c)利用特异性扩增mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的引物进行pcr扩增，确定mir-1287，mir-3131，mir-335mir-4419，mir-4468，mir-96的存在量；根据上述mirna的表达量计算患者score，若score高于0，则提示该受试者存在铂类化疗耐药的风险。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为训练集101例hgsoc化疗耐药与化疗敏感差异mirna聚类热图。

图2为lassocox模型挑选用于构建预测模型的mirna示意图。

图3为mirna预测模型在训练集、内部验证集和独立验证集中对hgsoc化疗耐药预测准确性示意图。

图4为mirna预测模型在训练集、内部验证集和独立验证集中对hgsocpfs预测准确性示意图。

图5为mirna预测模型与临床特征(年龄、分期、分级和手术残余灶大小)对hgsoc化疗耐药预测准确性比较示意图。

图6为基于rt-qpcr技术的mirna检测的50例患者模型评分统计图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现一种基于6个mirna对hgsoc铂类化疗耐药的预测模型。进一步的大样本验证发现，该模型预测效果要优于目前基于临床特征的预测效果。基于此，本发明提供了一种基于测定mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的表达量的预测高级别浆液性卵巢癌铂类化疗耐药性的方法，该方法较现有的预测高级别浆液性卵巢癌铂类化疗耐药性的方法具有更好的准确性。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96作为诊断标志物本发明人通过mirna芯片技术，比较分析了高级别浆液性卵巢癌64例铂类化疗敏感和37例铂类化疗耐药的多聚甲醛固定石蜡包埋组织切片中mirna的表达谱。利用mirna的相对表达量，筛选获得了多个表达差异较显著的mirna作为预测高级别浆液性卵巢癌铂类化疗耐药的标志物。将lassocox回归模型应用于挑选表达谱芯片中与耐药相关的差异mirna。我们选取λ的方法是1-标准差法，即一个方差范围内得到最简单模型的那一个λ值，并采用10倍交叉验证选取交叉验证误差最小的λ值。当λ取10时，有6个mirna被挑选出来，分别是：mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96。使用茎环引物(ribobio)以sybrgreen法(invitrogen)对差异mirna进行实时荧光定量pcr验证。每个样本设置3个复孔，以u6snrna为内参。每个mirna的表达值计算方法是2^-△ct法(△ct＝ctmirna–ctu6rna)基于以上6个mirna表达值利用lassocox回归模型建立了风险评分(score)方程。风险评分＝(0.26×mir-1287表达值)+(0.210×mir-3131表达值)+(0.146×mir-335表达值)+(0.116×mir-4419表达值)+(0.049×mir-4468表达值)–(0.124×mir-96表达值)。得到score最佳cutoff值为-0.0005。进而，本发明人通过回顾性研究，在大样本量中进行mirna表达研究，最终确定了基于mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96表达值的风险评分模型可应用于预测高级别浆液性卵巢癌铂类化疗耐药。

基于本发明的新发现，可以以mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96作为预测标志物(标记物)。通过分析待测样本(样品)中mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的表达情况，从而得知受试者是否对铂类化疗敏感，为为高级别浆液性卵巢癌的耐药预测提供依据。作为本发明的优选方式，当测得score得分大于-0.0005时，则判断提供该待测样本的受试者可能对铂类化疗不敏感。作为本发明的优选方式，所述的待测样品或待测样本是患者的多聚甲醛固定石蜡包埋组织样本。

mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的检测

作为本发明的一种选择方式，采用基于核酸扩增的mirna检测方法。一种基于核酸扩增的检测方法包括：

(1)提取待测样本中总rna(包含mirna)；

(2)对目的mirna(包括mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96)进行逆转录，合成相应的cdna；

(3)采用目的mirna(包括mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96)特异的上下游引物，通过pcr特异性扩增目的mirna，使检测信号放大；

(4)确定目的mirna(包括mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96)的表达量；根据风险评分模型计算score，当测得score得分大于-0.0005时，则判断提供该待测样本的受试者可能对铂类化疗不敏感。

检测mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的试剂盒作为本发明的一种可选方式，作为本发明的优选方式，提供了基于核酸扩增的mirna检测试剂盒，所述试剂盒中包括特异性扩增mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96的引物。较佳地，还包括：总rna提取试剂；逆转录试剂；mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-964逆转录引物；mirna的pcr检测试剂；mirna核酸扩增引物；阴性质控品和/或阳性质控品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：高级别浆液性卵巢癌铂类化疗耐药相关mirna标志物的筛选

mirna在制备高级浆液性上皮性卵巢癌化疗耐药性或复发的评价试剂中的应用：

1.病人组织及临床病理资料的采集

349例高级别浆液性上皮性卵巢癌的患者，其中101例作为训练集，98例作为内部验证集，150例作为独立验证集。

所有纳入的标本满足以下入组标准：

(1)所有患者均为原发性高级别浆液性卵巢癌，手术前未接受任何抗癌治疗。

(2)卵巢癌分期手术后，标本病理类型经病理医生审核为高级别浆液性卵巢癌。

(3)用于提取rna的标本为4张10μm的石蜡标本，且肿瘤组织不少于70％，坏死组织小于20％。

(4)石蜡组织提取的rna浓度≥10ng/μl。

(5)术后接受6-8个周期以铂类为基础的化疗。

(6)术后每6个月随访一次，复发后每3个月随访一次直至患者死亡或2014年12月随访截至。

卵巢癌化疗耐药定义为化疗结束后6个月内肿瘤进展或者复发，超过6个月肿瘤灭有进展或者复发视为化疗敏感。治疗效果评价参考实体瘤治疗反应评价标准(recist)。无病进展期(pfs)指手术后至肿瘤进展或复发的时间。满意的减瘤术为术后肿瘤残余灶≤1cm。

349例高级别浆液性上皮性卵巢癌总体临床病理特征

2.预测模型构建

(1)训练集101例ffpe组织rna提取，agilenthumanmirna8*60k检测mirna及质量控制。

训练集101例患者各取4张10μmffpe标本，使用qiagenmirneasyffpe试剂盒提取rna。nanodrop2000检测rna浓度，agilent2100bioanalyzersmallrnaassay对rna质检。每例标本取100ngrna按照agilent工作手册标记建库。芯片杂交洗涤后agilent扫描仪中选择相应的参数扫描。利用featureextraction软件(version10.7.1.1,agilenttechnologies)从扫描图片上提取得到原始数据。将原始数据导入genespring软件(version12.5,agilent)，利用quantile的方法得到标准化后的结果。在筛选差异mirna之前，先进行探针过滤，用于比较的每组样本中至少有一组75％标记为detected的探针留下进行后续分析。

(2)差异mirna筛选及实时荧光定量pcr验证(rt-qpcr)。

利用sam和t检验得到的差异显著性p值和标准化信号值的差异倍数foldchange值进行筛选，标准为fdr≤0.05，foldchange≥2.0且p≤0.05。使用茎环引物(购买自ribobio)以sybrgreen法(购买自invitrogen)对差异mirna进行实时荧光定量pcr验证。每个样本设置3个复孔，以u6snrna为内参。每个mirna的表达值计算方法是-△ct法(△ct＝ctmirna–ctu6rna)

10μl逆转录反应体系

以上体系混匀后，瞬时离心，rt反应程序为：42℃60min，70℃10min。

mirnaqpcr反应

mirnaqpcr反应程序

融解曲线分析，检测温度为70℃～95℃，升温速率为0.5/℃次，恒温时间为5sec/次。

(3)利用lassocox回归算法获得6个mirna评价标志物。

lasso回归是针对高维度数据建立预测模型的一种常用的回归模型。lasso回归的特点是在拟合广义线性模型的同时进行变量筛选和复杂度调整。因此，不论目标因变量是连续的，还是二元或者多元离散的，都可以用lasso回归建模然后预测。这里的变量筛选是指不把所有的变量都放入模型中进行拟合，而是有选择的把变量放入模型从而得到更好的性能参数。复杂度调整是指通过一系列参数控制模型的复杂度，从而避免过度拟合。lasso回归复杂度调整的程度由参数λ来控制，λ越大对变量较多的线性模型的惩罚力度就越大，从而最终获得一个变量较少的模型。已经有研究将lassocox回归模型应用于挑选表达谱芯片中与预后相关的差异基因，并表现出极强的预后预测价值。我们选取λ的方法是1-标准差法，即一个方差范围内得到最简单模型的那一个λ值，并采用10倍交叉验证选取交叉验证误差最小的λ值。训练集中，当λ取10时，有6个mirna被挑选出来，分别是：has-mir-1287，has-mir-3131,has-mir-335,has-mir-4419，has-mir-4468,has-mir-96。基于以上6个mirna表达值利用lassocox回归模型建立了风险评分方程。

风险评分＝(0.26×statusofmir-1287)+(0.210×statusofmir-3131)+(0.146×statusofmir-335)+(0.116×statusofmir-4419)+(0.049×statusofmir-4468)–(0.124×statusofmir-96)。

3.模型预测准确性验证

使用qiagenmirneasyffpe试剂盒提取101例训练集ffpe标本的rna，根据-△ct法(△ct＝ctmirna–ctu6rna)计算每个样本6个mirna的-△ct。将所得-△ct值以z-score的方法进行标准化，标准化后的数据对应风险评分方程中的status。将标准化后数据带入风险评分方程，得到每个患者的风险评分。

首先，将风险评分作为连续变量，对训练集化疗耐药反应性进行预测。我们对危险评分与化疗耐药的分布进行了观察，发现高分组人群化疗耐药的比例要显著高于低分组人群的比例。然后，我们利用roc曲线观察预测模型的准确性，发现auc＝0.847(95％ci0.765-0.929)。进而，根据风险评分与pfs时间的关系，利用x-tile自动选取cutoff值，得到最佳cutoff值为-0.0005。以该cutoff值将人群分成高分组与低分组，做kaplan-meier曲线比较两组人群pfs的差异。发现高分组人群pfs时间明显低于低分组人群(中位pfs：高分组vs低分组＝1.28年vs2.84年logrankp<0.001)。我们以同样的方法在98例内部验证集和150独立验证集对预测模型的准确性进一步验证。当危险评分作为连续变量时，我们对危险评分与化疗耐药的分布进行了观察，同样发现高分组人群化疗耐药的比例要显著高于低分组人群的比例。然后，我们利用roc曲线观察预测模型的准确性，发现内部验证集auc＝0.747(95％ci＝0.624-0.869)，独立验证集auc＝0.663(95％ci＝0.562-0.765)。在内部验证集和独立验证集中以cutoff值将人群分成高分组与低分组，做kaplan-meier曲线比较两组人群pfs的差异。发现高分组人群pfs时间明显低于低分组人群(内部验证集中位pfs：高分组vs低分组＝1.31年vs2.25年logrankp＝0.008，独立验证集中位pfs：高分组vs低分组＝1.33年vs2.37年logrankp<0.001)。

4.模型预测效果要与临床特征的预测效果比较

将风险评分作为二分类变量，比较其与临床病理特征(年龄，分期，分级，手术残余灶大小)对化疗耐药反应预测的准确性。在三个数据集(训练集，内部验证集和独立验证集)分别用风险评分和临床病理特征对卵巢癌患者铂类化疗反应性进行预测并绘制roc曲线，计算曲线下面积auc，均发现：风险评分的预测效果优于临床病理特征，具体数据如下：

训练集，该模型预测效果要优于目前临床特征的预测效果：风险评分auc＝0.743,95％ci＝0.638-0.849；年龄auc＝0.37995％ci＝0.252-0.497；分期auc＝0.46995％ci＝0.345-0.593；分级auc＝0.49395％ci＝0.372-0.614；手术残余灶大小auc＝0.54595％ci＝0.423-0.668。预测模型预测敏感度：0.778，特异度：0.709。

内部验证集，该模型预测效果要优于目前临床特征的预测效果：内部验证集风险评分auc＝0.707,95％ci＝0.573-0.842；年龄auc＝0.48295％ci＝0.330-0.635；分期auc＝0.30095％ci＝0.145-0.447；分级auc＝0.42695％ci＝0.268-0.583；手术残余灶大小auc＝0.55795％ci＝0.394-0.720；内部验证集预测敏感度：0.882，特异度：0.532

独立验证集，该模型预测效果要优于目前临床特征的预测效果：独立验证集风险评分auc＝0.699,95％ci＝0.608-0.791；年龄auc＝0.38695％ci＝0.285-0.486；分期auc＝0.39595％ci＝0.293-0.497；分级auc＝0.47595％ci＝0.374-0.577；手术残余灶大小auc＝0.56595％ci＝0.462-0.669；独立验证集预测敏感度：0.778，特异度：0.620。

在三个数据集(训练集，内部验证集和独立验证集)分别用风险评分和临床病理特征对卵巢癌患者铂类化疗反应性进行预测并绘制roc曲线，计算曲线下面积auc，均发现：风险评分的预测效果优于临床病理特征。

实施例2、mirna检测试剂盒的制备

基于rt-qpcr技术的试剂盒

本实施例中，所述基于核酸扩增的mirna检测试剂盒包括下列组成：

(1)总rna提取试剂：环保脱蜡剂，组织裂解缓冲液，蛋白酶k，trizol溶液，氯仿，异丙醇，乙醇，depc水；

(2)mirna逆转录试剂：逆转录酶、rna酶抑制剂、逆转录缓冲液、dntp混合物。

(3)mirna逆转录引物：mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96逆转录引物，用作内参的u6的逆转录引物。

(4)mirna的pcr检测试剂：taq酶、mg2+、pcr缓冲液、dntp混合物、核酸染料。

(5)mirna核酸扩增引物：mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96上游引物，mirnaqpcr通用下游引物。用作内参的u6的上游引物和下游引物。

上述逆转录引物以及核酸扩增引物均为市场上已经售卖的引物，本领域技术人员能够明了只要能够检测该mir，不同的引物类型也只是常规选择。

(6)阴性质控品：为不含核酸的rna稀释液。

(7)阳性质控品：为含一定量mirna的稀释物。

实施例3、基于rt-qpcr技术的mirna检测的临床应用

获取50位受试者的石蜡切片组织，应用如实施例2的rt-qpcr法进行mir-1287，mir-3131，mir-335，mir-4419，mir-4468，mir-96检测。根据测得的结果来判断受试者的铂类敏感情况，结果如下：

50例受试者中，铂类敏感患者29例，铂类耐药患者21例。依据实施例1中的截断值，铂类敏感的29例患者中22例检出为铂类敏感患者，铂类耐药的21例患者中16例检出为铂类耐药患者。

以上所述的实施例和具体实施方案对本发明做了相近的描述,但这并不能限制本发明的保护范围。对于本领域的技术人员，在本发明的基础上进行的若干改进或修改，也在本发明所要求的权利保护范围之内。