本发明涉及马铃薯黄矮病毒的联合基因检测试剂盒及检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境口岸检疫和农业生产上马铃薯黄矮病毒的快速检测和鉴定。
背景技术：
目前，已报道的马铃薯病毒种类约30余种，其中马铃薯黄矮病毒(potatoyellowdwarfvirus，pydv)被列为我国禁止进境的检疫性有害生物。pydv属于核型弹状病毒属(nucleorhabdovirus)成员，能引起马铃薯毁灭性病毒病――黄化矮缩病，其主要通过马铃薯种薯、介体昆体(叶蝉)、嫁接传毒，自然条件下可通过介体昆虫大面积传播。pydv分为sydv、cydv两个株系，其中sydv经由aceratagalliasanguinolenta传播，而agalliaconstricra不能传，cydv经由agalliaconstricta传播，而aceratagalliasanguinolenta不能传。sydv和cydv病毒粒体的结构蛋白存在差异。迄今为止，pydv已报道发生的国家主要为加拿大和美国，我国迄今尚未有发生的报道。随着我国对外贸易的迅速发展，进口的马铃薯种薯数量呈逐年上升趋势，该病毒随之传入的风险越来越大。由于pydv的寄主范围广，我国的气候条件又适合传毒介体的繁殖，一旦其传入，在我国定殖、传播，势必对马铃薯生产造成毁灭性的危害。因此，加强进境马铃薯上该病毒的检测，对预防和控制该病毒的发生和扩散具有极其重要的意义。
关于pydv的检测，目前主要采用生物学测定、电镜观察、血清学elisa等传统方法。生物学测定易受人为因素的影响，且需要专门的隔离场所；电镜观察不仅需要专门的仪器设备，还需要专门的操作技术人员，不适合大范围推广应用。血清学das-elisa检测试剂绝大多数购自国外，国内还未商品化生产，检测成本昂贵、到货周期长，同时还存在灵敏度不足的缺点。基于核酸水平的pcr扩增技术具有快速、微量和灵敏等优点，近年来已广泛应用于植物病毒的检测诊断。目前已报道的pcr检测pydv技术，仅国外有报道采用普通rt-pcr的方法。普通rt-pcr方法的不足之处在于结果判断需要通过琼脂糖凝胶电泳检测和基因测序，易污染、耗时长。在普通rt-pcr基础上的实时荧光定量rt-pcr方法检测植物病毒，具有特异性更强、灵敏度更高、时间更快、操作更安全的优点。但到目前为止，尚未见专门用于pydv检测的实时荧光定量rt-pcr方法报道，更未见基于联合基因检测的实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒及检测方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确地检测进出境及农业生产上的马铃薯黄矮病毒。为了解决上述技术问题，本发明克服了现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种基于实时荧光定量rt-pcr技术的马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒及检测方法。
第一方面，本发明保护用于检测或辅助检测马铃薯黄矮病毒的成套试剂。
本发明提供的用于检测或辅助检测马铃薯黄矮病毒的成套试剂为如下(1)-(3)中任一种：
(1)由成套试剂甲和成套试剂乙组成；
所述成套试剂甲由特异引物对甲和荧光探针甲组成；
所述成套试剂乙由特异引物对乙和荧光探针乙组成；
(2)所述成套试剂甲；
(3)所述成套试剂乙；
所述特异引物对甲由引物pydv-f1和引物pydv-r1组成；
所述荧光探针甲为探针pydv-probe1；
所述特异引物对乙由引物pydv-f2和引物pydv-r2组成；
所述荧光探针乙为探针pydv-probe2；
所述引物pydv-f1为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；
所述引物pydv-r1为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；
所述探针pydv-probe1为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链dna分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；
所述引物pydv-f2为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列4所示的单链dna分子；
b2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；
所述引物pydv-r2为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列5所示的单链dna分子；
b4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链dna分子；
所述探针pydv-probe2为如下b5)或b6)：
b5)序列表中序列6所示的单链dna分子；
b6)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链dna分子。
上述成套试剂中，所述成套试剂甲用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因；所述成套试剂乙用于检测马铃薯黄矮病毒np基因。在实际应用中，可以联合使用成套试剂甲和成套试剂乙进行马铃薯黄矮病毒的检测，也可以单独使用成套试剂甲或成套试剂乙进行马铃薯黄矮病毒的检测。
进一步的，所述探针pydv-probe1和所述探针pydv-probe2的5’端均标记有荧光集团；所述探针pydv-probe1和所述探针pydv-probe2的3’端均标记有淬灭集团。在本发明中，所述荧光集团具体为fam，所述淬灭集团具体为tamra。
更进一步的，所述成套试剂甲中，所述引物pydv-f1、所述引物pydv-r1和所述探针pydv-probe1的摩尔比为2:2:1；
所述成套试剂乙中，所述引物pydv-f2、所述引物pydv-r2和所述探针pydv-probe2的摩尔比为2:2:1。
第二方面，本发明保护上述成套试剂的新用途。
本发明保护上述成套试剂在如下c1)-c6)中任一所述的应用：
c1)制备用于检测或辅助检测马铃薯黄矮病毒的产品；
c2)检测或辅助检测马铃薯黄矮病毒；
c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为马铃薯黄矮病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为马铃薯黄矮病毒；
c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染马铃薯黄矮病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测样品是否感染马铃薯黄矮病毒。
第三方面，本发明保护含有上述成套试剂的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：
d1)检测或辅助检测马铃薯黄矮病毒；
d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为马铃薯黄矮病毒；
d3)检测或辅助检测待测样品是否感染马铃薯黄矮病毒。
进一步的，本发明的试剂盒还包括含有马铃薯黄矮病毒的阳性对照样品和不含有马铃薯黄矮病毒的阴性对照样品。
更进一步的，本发明的试剂盒由如下试剂组成：引物pydv-f1(10μmol/l)、引物pydv-r1(10μmol/l)、探针pydv-probe1(5μmol/l)、引物pydv-f2(10μmol/l)、引物pydv-r2(10μmol/l)、探针pydv-probe2(5μmol/l)、rtbuffer(5×)、随机引物(100μmol/l)、rna酶抑制因子(40u/μl)、dntps(10mmol/l)、反转录酶(200u/μl)、taqmanpcrmix(2×)、含有马铃薯黄矮病毒的阳性对照样品、不含马铃薯黄矮病毒的阴性对照样品和rnase-freeddh2o。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒的制备方法为如下(ⅰ)或(ⅱ)：
(ⅰ)上述成套试剂中各引物对的各条引物和探针分别单独包装；
(ⅱ)上述成套试剂中各引物对的各条引物和探针按比例混合在一起。
第四方面，本发明保护一种鉴定待测病毒是否为马铃薯黄矮病毒的方法。
本发明提供的鉴定待测病毒是否为马铃薯黄矮病毒的方法包括如下步骤：以待测病毒的cdna为模板，采用上述成套试剂进行实时荧光定量rt-pcr；
若待测病毒的ct值<35时，则所述待测病毒为马铃薯黄矮病毒；
若待测病毒的ct值>40时，则所述待测病毒不为马铃薯黄矮病毒；
若待测病毒的35≤ct值≤40时，则以所述待测病毒的cdna为模板，采用上述成套试剂重新进行测试：若重新测试的ct值＜40，则所述待测病毒为马铃薯黄矮病毒；若重新测试的ct值≥40时，则所述待测病毒不为马铃薯黄矮病毒。
第五方面，本发明保护一种检测或辅助检测待测样品是否感染马铃薯黄矮病毒的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染马铃薯黄矮病毒的方法包括如下步骤：以待测样品的cdna为模板，采用上述成套试剂进行实时荧光定量rt-pcr；
若待测样品的ct值<35时，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒；
若待测样品的ct值>40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒；
若待测样品的35≤ct值≤40时，则以所述待测样品的cdna为模板，采用上述成套试剂重新进行测试：若重新测试的ct值＜40，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒；若重新测试的ct值≥40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
上述方法中，所述成套试剂可联合使用成套试剂甲和成套试剂乙，也可单独使用成套试剂甲或成套试剂乙。
进一步的，所述方法还包括以含有马铃薯黄矮病毒的样品作为阳性对照样品，以不含有马铃薯黄矮病毒的样品作为阴性对照样品的步骤。所述阴性对照样品无ct值且无扩增曲线；所述阳性对照样品ct值≤30且出现典型扩增曲线。
更进一步的，若使用成套试剂甲和成套试剂乙进行实时荧光定量rt-pcr时，所述实时荧光定量rt-pcr的反应体系如下：cdna2μl、2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-f11μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-r11μl、浓度为5μmol/l的探针pydv-probe11μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-f21μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-r21μl、浓度为5μmol/l的探针pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o4.5μl。
若使用成套试剂甲进行实时荧光定量rt-pcr时，所述实时荧光定量rt-pcr的反应体系如下：cdna2μl、2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-f11μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-r11μl、浓度为5μmol/l的探针pydv-probe11μl、rnase-freeddh2o7.5μl。
若使用成套试剂乙进行实时荧光定量rt-pcr时，所述实时荧光定量rt-pcr的反应体系如下：cdna2μl、2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-f21μl、浓度为10μmol/l的引物pydv-r21μl、浓度为5μmol/l的探针pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o7.5μl。
所述实时荧光定量rt-pcr的反应条件如下：95℃预变性10s；95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，如此共40个循环。
上述方法中，所述cdna是以待测病毒或待测样品的rna为模板进行反转录得到的。所述反转录的具体方法如下：将待测病毒或待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl和浓度为100μmol/l的随机引物1μl混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
较现有技术而言，本发明所提供的联合基因检测试剂盒及检测方法有益效果在于：
1)特异性更强：本发明基于联合基因检测pydv，由于同时包括马铃薯黄矮病毒np基因保守区域、马铃薯黄矮病毒rdrp基因保守区域，且特异性引物和特异性荧光探针在pcr过程中可以对靶目标进行双重控制，因此能有效避免非特异性扩增；无论是sydv株系，还是cydv株系，均能够准确检测。
2)灵敏度更高：由于实时荧光定量rt-pcr将荧光标记、pcr、激光及数码显像等多个技术相结合，灵敏度显著高于普通rt-pcr，并能对病毒进行准确定量。本发明的联合基因检测pydv的灵敏度，与两种病毒的单一实时荧光定量rt-pcr灵敏度相当，能够用于极微量病毒的检测。
3)操作简便、安全：实时荧光定量rt-pcr整个扩增过程可以通过电脑软件进行实时监测，掌握pcr扩增情况，扩增结果在电脑上直接显示。与普通rt-pcr相比，无需开盖、电泳、染色及紫外观察等步骤，避免了使用有毒试剂。
4)快速、检测样本量大：实时荧光定量rt-pcr整个检测过程在2-3小时内即可完成，且一次可以同时检测大批量样品。
本发明针对马铃薯黄矮病毒rdrp基因保守区域和马铃薯黄矮病毒np基因保守区域的基因序列，反复设计、筛选出了特异性引物和荧光探针，并经引物浓度、荧光探针浓度、退火温度、延伸时间和循环数等参数的无数次优化确定了最佳实时荧光定量rt-pcr反应体系和反应条件，提供了马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒及检测方法。通过实验证明：本发明的马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒及检测方法能够用于马铃薯黄矮病毒的准确检测和鉴定，具有检测时间快、特异性强、灵敏度高、操作简便、安全和高通量的优点。
附图说明
图1为实施例2的马铃薯黄矮病毒的联合基因检测试剂盒的检测结果。其中，1：感染马铃薯黄矮病毒的样品；2：阴性对照；3：空白对照。
图2为实施例3的用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因的引物、荧光探针检测马铃薯黄矮病毒的检测结果。其中，1：感染马铃薯黄矮病毒的样品；2：阴性对照；3：空白对照。
图3为实施例3的用于检测马铃薯黄矮病毒np基因的引物、荧光探针检测马铃薯黄矮病毒的检测结果。其中，1：感染马铃薯黄矮病毒的样品；2：阴性对照；3：空白对照。
图4为实施例4的特异性的检测结果。其中，1：马铃薯黄矮病毒(pydv)样品；2：马铃薯x病毒(pvx)样品；3：马铃薯y病毒(pvy)样品；4：马铃薯a病毒(pva)样品；5：马铃薯s病毒(pvs)样品；6：马铃薯m病毒(pvm)样品；7：马铃薯v病毒(pvv)样品；8：马铃薯卷叶病毒(plrv)样品；9：烟草花叶病毒(tmv)样品；10：阴性对照。
图5为实施例5的灵敏度的检测结果。其中，1：100；2：10-1稀释；3：10-2稀释；4：10-3稀释；5：10-4稀释；6：10-5稀释；7：10-6稀释；8：10-7稀释；9：阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒及检测方法
一、用于检测马铃薯黄矮病毒的成套特异性引物、荧光探针
本发明根据马铃薯黄矮病毒rdrp基因保守区域、马铃薯黄矮病毒np基因保守区域，设计并筛选出2套特异性引物和荧光探针。
本发明设计的用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因的引物、荧光探针由引物pydv-f1、引物pydv-r1和荧光探针pydv-probe1组成。引物、荧光探针序列如下：
pydv-f1：5’-ggtcaaatcggaaatgag-3’(序列1)；
pydv-r1：5’-ctggttacagtgatcaga-3’(序列2)；
pydv-probe1：5’-fam-taagcggcaaccaactgtcg-tamra-3’(序列3)；
本发明设计的用于检测马铃薯黄矮病毒np基因的引物、荧光探针由引物pydv-f2、引物pydv-r2和荧光探针pydv-probe2组成。引物、荧光探针序列如下：
pydv-f2：5’-ctaccattagaacaagttacg-3’(序列4)；
pydv-r2：5’-ggtggataactgttgaag-3’(序列5)；
pydv-probe2：5’-fam-cagtcagcggaagtcaccaatt-tamra-3’(序列6)；
用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因的特异性引物、荧光探针及用于检测马铃薯黄矮病毒np基因的特异性引物、荧光探针共同组成了本发明的用于检测马铃薯黄矮病毒的成套特异性引物、荧光探针。
二、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒的配置(10次检测量)
本发明的马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒由如下1)-15)所示的试剂组成：
1)pydv-f1：10μmol/l，1管(15μl)；
2)pydv-r1：10μmol/l，1管(15μl)；
3)pydv-probe1：5μmol/l，1管(15μl)；
4)pydv-f2：10μmol/l，1管(15μl)；
5)pydv-r2：10μmol/l，1管(15μl)；
6)pydv-probe2：5μmol/l，1管(15μl)；
7)rtbuffer：5×，1管(100μl)；
8)随机引物：100μmol/l，1管(20μl)；
9)rna酶抑制因子：40u/μl，1管(20μl)；
10)dntps：10mmol/l，1管(30μl)；
11)反转录酶：200u/μl，1管(20μl)；
12)taqmanpcrmix：2×，1管(150μl)；
13)含有马铃薯黄矮病毒阳性对照样品，1管(100μl)；
14)不含马铃薯黄矮病毒的阴性对照样品，1管(100μl)；
15)rnase-freeddh2o，1管(1ml)。
实施例2、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒的检测方法
一、马铃薯黄矮病毒联合基因的实时荧光定量rt-pcr反应体系的建立及反应条件的优化
以感染马铃薯黄矮病毒的样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤如下：
1)反转录：向pcr管中加入待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl和浓度为100μmol/l的随机引物1μl，混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
2)荧光定量pcr反应体系的配置：取步骤1)合成的cdna2μl，每管加入2×taqmanpcrmix12.5μl、不同浓度的pydv-f11μl、不同浓度的pydv-r11μl、不同浓度的pydv-probe11μl、不同浓度的pydv-f21μl、不同浓度的pydv-r21μl、不同浓度的pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o4.5μl，混匀，得到反应液。
3)荧光定量pcr反应条件：将步骤2)获得的反应液在下述条件下反应：95℃预变性10s，然后95℃变性5s、不同温度下退火10s、72℃下延伸不同时间，如此进行不同个数的循环，反应结束。
上述步骤2)中的“不同浓度”分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l。用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因的特异性引物、荧光探针及用于检测马铃薯黄矮病毒np基因的特异性引物、荧光探针均做了不同浓度之间的排列组合，如pydv-f1引物的浓度为20μmol/l时，pydv-r1引物的浓度分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l，pydv-probe1荧光探针的浓度分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l，pydv-f2引物的浓度分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l，pydv-r2引物的浓度分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l，pydv-probe2荧光探针的浓度分别为20μmol/l、10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l。
上述步骤3)中的“不同温度”分别为48℃、48.5℃、49℃、49.5℃、50℃、50.5℃、51℃、51.5℃、52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、54℃、54.5℃、55℃、55.5℃、56℃、56.5℃、57℃、57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、59.5℃或60℃。
上述步骤3)中的“不同时间”分别为5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s。
上述步骤3)中的“不同个数”分别为5个、10个、25个、30个、35个或40个。
实时荧光定量rt-pcr的结果表明：最佳反应体系为：cdna2μl、2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的pydv-f11μl、浓度为10μmol/l的pydv-r11μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe11μl、浓度为10μmol/l的pydv-f21μl、浓度为10μmol/l的pydv-r21μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o4.5μl，反应总体积为25μl；最佳反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，如此共40个循环，反应结束。
二、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒的检测方法
以感染马铃薯黄矮病毒的样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤如下：
1)反转录：向pcr管中加入待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl和浓度为100μmol/l的随机引物1μl，混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
2)荧光定量pcr：取步骤1)合成的cdna2μl，每管加入2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的pydv-f11μl、浓度为10μmol/l的pydv-r11μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe11μl、浓度为10μmol/l的pydv-f21μl、浓度为10μmol/l的pydv-r21μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o4.5μl，混匀，得到反应液，反应液的总体积为25μl；将反应液在下述条件下反应：95℃预变性10s；95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，如此共40个循环，反应结束。
3)结果判定：若在阴性对照无ct值且无扩增曲线、阳性对照ct值≤30且出现典型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值<35时，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的ct值>40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的35≤ct值≤40时，重新进行测试一次，如果重新测试的ct值＜40，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒，如果重新测试的ct值≥40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
实时荧光定量rt-pcr扩增结果如图1所示。感染马铃薯黄矮病毒的待测样品出现典型扩增曲线，ct值为21.3。
实施例3、针对单一基因检测马铃薯黄矮病毒的检测方法
一、用于检测马铃薯黄矮病毒rdrp基因的引物、荧光探针检测马铃薯黄矮病毒的方法
以感染马铃薯黄矮病毒的样品作为待测样品，针对马铃薯黄矮病毒rdrp基因，采用实时荧光定量rt-pcr检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤如下：
1)反转录：向pcr管中加入待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl和浓度为100μmol/l的随机引物1μl，混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
2)荧光定量pcr：取步骤1)合成的cdna2μl，每管加入2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的pydv-f11μl、浓度为10μmol/l的pydv-r11μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe11μl、rnase-freeddh2o7.5μl，混匀，得到反应液，反应液的总体积为25μl；将反应液在下述条件下反应：95℃预变性10s；95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，如此共40个循环，反应结束。
3)结果判定：若在阴性对照无ct值且无扩增曲线、阳性对照ct值≤30且出现典型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值<35时，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的ct值>40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的35≤ct值≤40时，重新进行测试一次，如果重新测试的ct值＜40，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒，如果重新测试的ct值≥40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
实时荧光定量rt-pcr扩增结果如图2所示。感染马铃薯黄矮病毒的待测样品出现典型扩增曲线，ct值为21.7。
二、用于检测马铃薯黄矮病毒np基因的引物、荧光探针检测马铃薯黄矮病毒的方法
以感染马铃薯黄矮病毒的样品作为待测样品，针对马铃薯黄矮病毒np基因，采用实时荧光定量rt-pcr检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤如下：
1)反转录：向pcr管中加入待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl和浓度为100μmol/l的随机引物1μl，混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
2)荧光定量pcr：取步骤1)合成的cdna2μl，每管加入2×taqmanpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的pydv-f21μl、浓度为10μmol/l的pydv-r21μl、浓度为5μmol/l的pydv-probe21μl、rnase-freeddh2o7.5μl，混匀，得到反应液，反应液的总体积为25μl；将反应液在下述条件下反应：95℃预变性10s；95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，如此共40个循环，反应结束。
3)结果判定：若在阴性对照无ct值且无扩增曲线、阳性对照ct值≤30且出现典型扩增曲线的条件下，待测样品的ct值<35时，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的ct值>40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒；待测样品的35≤ct值≤40时，重新进行测试一次，如果重新测试的ct值＜40，则所述待测样品感染马铃薯黄矮病毒，如果重新测试的ct值≥40时，则所述待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
实时荧光定量rt-pcr扩增结果如图3所示。感染马铃薯黄矮病毒的待测样品出现典型扩增曲线，ct值为20.1。
实施例4、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒的特异性测定
分别以感染马铃薯黄矮病毒(pydv)、马铃薯x病毒(pvx)、马铃薯y病毒(pvy)、马铃薯a病毒(pva)、马铃薯s病毒(pvs)、马铃薯m病毒(pvm)、马铃薯v病毒(pvv)、马铃薯卷叶病毒(plrv)、烟草花叶病毒(tmv)的样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤同实施例2步骤二中的1)-3)。
结果如图4所示。感染马铃薯黄矮病毒(pydv)样品出现典型扩增曲线，ct值为22.5，而马铃薯x病毒(pvx)、马铃薯y病毒(pvy)、马铃薯a病毒(pva)、马铃薯s病毒(pvs)、马铃薯m病毒(pvm)、马铃薯v病毒(pvv)、马铃薯卷叶病毒(plrv)、烟草花叶病毒(tmv)样品和阴性对照样品均未出现典型扩增曲线。说明本发明的试剂盒具有较强的特异性。
实施例5、马铃薯黄矮病毒联合基因检测试剂盒的灵敏度测定
以感染马铃薯黄矮病毒(pydv)的样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。先按实施例2步骤二的1)中的方法制备cdna，然后将cdna分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6倍后作为待测样品，再按照实施例2步骤二的2)-3)中的方法检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。
结果如图5所示。从图5中可以看出，本发明试剂盒具有很高的灵敏度，最低可以检测稀释到10-5倍的马铃薯黄矮病毒(pydv)样品。
实施例6、进口及田间马铃薯样品的检测
选取口岸进境的马铃薯样品和我国田间采集的马铃薯样品作为待测样品，共380份。提取待测样品的rna后采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的马铃薯黄矮病毒。具体步骤同实施例2步骤二中的1)-3)。试验同时以普通rt-pcr方法和das-elisa方法进行验证。
普通rt-pcr方法的具体步骤如下：
1)反转录：向pcr管中加入待测样品总rna3μl、rnase-freeddh2o7μl、浓度为10μmol/l的反向引物pydv-r(序列为：5′-ctattttcccctcagtagtccac-3′)1μl，混匀，70℃水浴10min后再冰浴5min，依次加入5×rtbuffer5μl、浓度为200u/μl的反转录酶1μl、浓度为10mmol/l的dntps2μl和浓度为40u/μl的rna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min后再70℃水浴10min，冷却至室温，合成cdna。
2)普通rt-pcr反应：在pcr管中加入步骤1)合成的cdna2μl，每管加入2×taqpcrmix12.5μl、浓度为10μmol/l的pydv-f(序列为：5′-atattcatttccaggcttgcat-3′)1μl、浓度为10μmol/l的pydv-r1μl和ddh2o8.5μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min；95℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束。
3)pcr扩增产物电泳检测：取pcr反应产物10μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。若pcr扩增产物在588bp处均出现明亮的dna条带，则待测样品感染马铃薯黄矮病毒，否则待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
das-elisa的具体步骤如下：
1)包被抗体：将pydv抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度(500倍)，加入到酶联板的孔中，100μl/孔，37℃孵育2h。
2)加样品：倒去酶联板中包被抗体溶液，用pbst缓冲液洗涤3次；加入100μl样品提取液到酶联板的孔中，100μl/孔，37℃孵育2h或4℃过夜。
3)加酶标抗体：将酶标抗体用酶标抗体缓冲液稀释至工作浓度(500倍)，加入到酶联板的孔中，100μl/孔，37℃孵育2h。
4)加底物：倒去酶联板中酶标抗体溶液，用pbst缓冲液洗涤3次；将底物pnpp用底物缓冲液配制为终浓度1mg/ml(现配现用)，加入到酶联板的孔中，100μl/孔，室温避光放置约30-60min。
5)用酶标仪在405nm处读取吸光值(od405nm)。若样品od405nm值/阴性对照od405nm值>2，则待测样品感染马铃薯黄矮病毒，否则待测样品未感染马铃薯黄矮病毒。
结果如表1所示。从表1可以看出：本发明的方法检出感染马铃薯黄矮病毒(pydv)的样品17份，全部为口岸进境的马铃薯样品，国内田间采集的样品均未检出感染马铃薯黄矮病毒(pydv)的样品。在国外17份检出马铃薯黄矮病毒(pydv)的样品中，普通rt-pcr、das-elisa方法仅分别检出7份和4份，检出率均显著低于比本发明的方法；国内样品的普通rt-pcr、das-elisa方法验证结果与本发明方法的结果完全一致。上述结果证实本发明的方法准确可靠，且灵敏度更高。
表1马铃薯样品的检测结果
注：+表示检出pydv；/表示未检出pydv。
序列表
<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>马铃薯黄矮病毒的联合基因检测试剂盒及检测方法
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggtcaaatcggaaatgag18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ctggttacagtgatcaga18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
taagcggcaaccaactgtcg20
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctaccattagaacaagttacg21
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ggtggataactgttgaag18
<210>6
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cagtcagcggaagtcaccaatt22