植物乳杆菌CQPC02及其在制备改善便秘的食品中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌及其在制备食品中的应用。

背景技术：

四川泡菜的生产过程是将新鲜的泡菜洗净，将泡菜密封在坛内，在盐水中厌氧发酵浸泡的泡菜。泡菜水中含有丰富的天然乳酸菌，对泡菜风味和品质的形成起着关键作用。其使用可溶性成分(主要是糖和含氮物质)进行增殖，产生酸性物质并代谢出风味成分，使泡菜产生了独特的酸脆口味。泡菜水中含有的微生物主要包括植物乳杆菌、l.短杆菌、干酪乳杆菌、发酵酵母菌、嗜酸乳杆菌等。乳酸菌种类的差异可能是由于地域、气候和生产工艺习惯等因素造成的。某些乳酸菌也被用作益生菌，对人体健康有多种益处，包括改善便秘、结肠炎和减肥等。为了更好的利用这些微生物资源，应开展更广泛的分离和鉴定工作，积累丰富的菌种资源，开发出丰富的工业用益生菌种类。

技术实现要素：

本发明的目的在于对泡菜水中的微生物进行分离鉴定，并对其活性和应用进行研究。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cqpc02，保藏编号为cgmccno.14491。

2.植物乳杆菌cqpc02在制备改善便秘的食品中的应用。

进一步，所述食品为发酵饮料。

更进一步，所述食品为发酵豆奶。

3.由植物乳杆菌cqpc02发酵制成的饮料。

进一步，所述饮料为豆奶。

4.由植物乳杆菌cqpc02发酵制备豆奶的方法，包括以下步骤：用相当于大豆质量3倍的水浸泡大豆12小时，然后磨浆，过滤，以浓度10⁵cfu/ml接种植物乳杆菌cqpc02，37℃发酵12小时。

本发明对泡菜水中的微生物进行了分离鉴定，将其中一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)命名为cqpc02，于2017年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.14491。

高效液相色谱(hplc)法测定结果显示，与未发酵豆奶(u-fsm)和保加利亚乳杆菌发酵豆奶(lb-fsm)相比，植物乳杆菌cqpc02发酵豆奶(lp-cqpc02-fsm)中大豆异黄酮总含量最高，且含有更多的游离型糖苷(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)。

lp-cqpc02-fsm对活性炭诱导便秘小鼠的实验结果显示：与模型组相比，lp-cqpc02-fsm能促进肠道蠕动，提高小肠推进率，缩短首粒黑便时间，能显著提高便秘小鼠血清mtl(胃动素)、gas(胃泌素)、et(内皮素)、ache(乙酰胆碱酶)、sp(p物质)和vip(血管活性肠肽)水平，同时显著降低ss(生长抑素)水平，能增加便秘小鼠小肠中c-kit、scf、gdnf和aqp9的mrna表达，同时减少trpv1和aqp3的mrna表达，对便秘具有良好的改善效果，显著优于u-fsm和lb-fsm。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种植物乳杆菌cqpc02，可以用于制备改善便秘的食品例如发酵饮料(例如发酵豆奶)，可以有效地抑制便秘，且效果优于常用的保加利亚乳杆菌，不仅扩大了植物乳杆菌cqpc02的应用范围，提高了其应用价值，而且给便秘的改善带来了新的希望。

附图说明

图1为植物乳杆菌cqpc02的菌落形态。

图2为植物乳杆菌cqpc02的革兰氏染色结果。

图3为植物乳杆菌cqpc02的16srdnapcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准，0为阴性对照，1为植物乳杆菌cqpc02。

图4为hplc法测定豆奶中大豆异黄酮的含量，其中a为混合标准液，b为-fsm)，c为lb-fsm，d为lp-cqpc02-fsm；1—6号色谱峰依次为大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素。

图5为小鼠首粒黑便时间，^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

图6为小鼠小肠组织病理学切片观察。

图7为小鼠小肠中c-kit和scfmrna表达水平，^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

图8为小鼠小肠中trpv1和gdnfmrna表达水平，^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

图9为小鼠小肠中aqp3和aqp9mrna表达水平，^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、植物乳杆菌cqpc02的分离与鉴定

1、实验材料

采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40ml泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。

2、乳酸菌的分离纯化

分别取1ml泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，然后取10^-4、10^-5、10^-63个梯度的菌液100μl进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

编号为cqpc02的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。

3、乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5mlmrs液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1ml于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。

编号为cqpc02的菌株革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。

4、乳酸菌dna提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于mrs肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组dna提取试剂盒进行dna提取。提取的dna放于-20℃冰柜保藏备用。

5、基因组dnapcr扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的dna，pcr扩增16srdna，其中上游引物27f(5'－agagtttgatcctggctcag－3'，seqidno.1)1μl、下游引物1495r(5'－ctacggctaccttgttacga－3'，seqidno.2)1μl，2×taqplusbuffer12.5μl、模板dna1μl，用无菌ddh2o将体系补足至25μl。并以无菌超纯水替代模板dna作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃延伸5min。然后取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110v，45min。

编号为cqpc02的菌株16srdna扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，阴性对照组的泳道无条带，表明pcr扩增过程中未受到污染；编号为cqpc02的菌株的泳道有一条长度约为1500bp的条带，符合预期扩增片段的长度。

将编号为cqpc02的菌株的16srdna扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，测得序列如seqidno.3所示。使用ncbi中的blast(basiclocalalignmentsearchtool)程序对测得序列进行比对分析，结果显示，编号为cqpc02的菌株为乳酸菌中的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，其与genebank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％。

6、乳酸菌体外抗性筛选

(1)耐受0.3％胆盐的能力

在mrs-thio培养基(含0.2％巯基乙酸钠的mrs肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min；将活化好的5ml菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的mrs-thio培养基和含0.3％胆盐的mrs-thio培养基中，以空白培养基(未接菌的mrs-thio培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的od600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力：

结果显示，编号为cqpc02的菌株在0.3％胆盐中的存活率为17.3±0.19％，具有较强的耐受胆盐能力。

(2)人工胃液耐受性试验

人工胃液的配制：由0.2％nacl和0.35％胃蛋白酶组成，用1mol/lhcl调节ph为3.0，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。

在超净工作台中吸取5ml培养好的含菌培养基于10ml无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入等体积(5ml)无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1ml菌悬液与9mlph3.0的人工胃液混匀，此时取1ml上述混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9ml混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在mrs固体培养基上37℃培养48h，按公式(2)计算存活率(％)。

结果显示，编号为cqpc02的菌株在ph3.0人工胃液中的存活率为92.06±6.91％，具有较强的抗胃酸能力。

二、植物乳杆菌cqpc02发酵豆奶

用相当于大豆质量3倍量的水浸泡大豆(1kg)12h，然后磨浆，过滤，分别以浓度10⁵cfu/ml接种植物乳杆菌cqpc02和保加利亚乳杆菌，37℃发酵12h，获得植物乳杆菌cqpc02发酵豆奶(lp-cqpc02-fsm)和保加利亚乳杆菌发酵豆奶(lb-fsm)。另以未发酵豆奶(u-fsm)作为对照。

三、hplc法测定豆奶中大豆异黄酮的含量

大豆中除了蛋白质等一般成分，还含有具有肠道益生功能的大豆异黄酮类物质。经过乳酸菌的发酵后，豆奶中存在的结合型大豆异黄酮将转化为更容易消化吸收的游离型大豆异黄酮。

1、色谱条件

色谱柱：pntulisqs-c18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相a：乙腈；流动相b：0.1‰磷酸；检测波长：254nm；柱温：40℃；流速：1ml/min；进样量：10μl。梯度洗脱流动相比例见表1。

表1梯度洗脱流动相比例

2、标准品溶液的制备

分别精密称取大豆苷20mg、黄豆黄苷20mg、染料木苷20mg、大豆苷元20mg、黄豆黄素20mg、染料木素20mg于20ml容量瓶中，用80％甲醇溶解并稀释至刻度，作为单一标准品储备液。

将每种单一标准品储备液分别稀释6、12、24、36、48倍，制成系列浓度的单一标准品溶液。

分别取6种单一标准品储备液各1ml于10ml容量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，作为混合标准品溶液。

3、系统适用性实验

分别精密吸取6种单一标准品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，确定大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的保留时间分别为16.899、18.298、26.582、39.483、41.325、48.525min。然后精密吸取混合标准品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(见图4a)，根据保留时间及紫外图谱显示的最大吸收波长，确定色谱图中1—6号色谱峰依次为大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素，相邻峰之间的分离度符合要求。

4、供试品溶液的制备

分别取u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm2ml于50ml容量瓶中，加入80％甲醇至近刻度，50℃超声1h，用80％甲醇稀释至刻度，混匀，9000r/min离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

5、标准曲线的绘制

分别精密吸取系列浓度的单一标准品溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(y)对进样量(x)进行线性回归。6种大豆异黄酮标准品的回归方程见表2。

表26种大豆异黄酮标准品的回归方程

6、供试品溶液的测定

精密吸取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，用表2所列回归方程以峰面积计算豆奶中6种大豆异黄酮的含量。u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm的色谱图分别见图4b、4c和4d，可见u-fsm和lb-fsm含有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素，lp-cqpc02-fsm除了含有以上五种大豆异黄酮外还含有黄豆黄素。u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm中大豆异黄酮含量计算结果见表3，可见与u-fsm和lb-fsm相比，lp-cqpc02-fsm中的大豆异黄酮总含量最高，且含有更多的游离型糖苷(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)与更少的结合型糖苷(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷)。从这些结果看出，与保加利亚乳杆菌相比，植物乳杆菌cqpc02在发酵豆奶的过程中能产生更多活性的大豆异黄酮。

表3豆奶中大豆异黄酮的含量(μg/ml)

四、植物乳杆菌cqpc02发酵豆奶对便秘模型小鼠的改善作用

1、实验动物

spf级6周龄雌性昆明小鼠，50只，购于重庆医科大学实验动物中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。

2、实验方法

50只小鼠适应性喂养一周后，随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、u-fsm组、lb-fsm组和lp-cqpc02-fsm组。整个实验周期为9天，正常组和模型组每天灌胃生理盐水，u-fsm组、lb-fsm组和lp-cqpc02-fsm组每天分4次分别灌胃u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm共计2ml；从第7天至第9天，除正常组小鼠外，其余各组小鼠每天另外灌胃10％活性炭冰水0.2ml。

3、首粒黑便时间与小肠推进率计算

第9天灌胃完成之后，所有小鼠禁食不禁水24h，第10天所有小鼠均灌胃10％活性炭冰水0.2ml，然后将每组小鼠分为两小组，5只小鼠从灌胃活性炭冰水开始观察其排出首粒黑便的时间；剩余5只小鼠在灌胃活性炭冰水30min后处死并收集血浆备用，取上自幽门、下至回盲部的小肠部分，测量小肠长度和活性炭在小肠中的推进距离，按公式(3)计算小肠推进率。

首粒黑便时间是评价便秘严重程度的重要指标，当出现便秘症状时，肠道蠕动减慢，粪便在肠道中滞留时间变长。各组小鼠的首粒黑便时间如图5所示，模型组小鼠的首粒黑便时间最长，显著高于正常组小鼠(p<0.05)；u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm分别灌胃小鼠后，虽然其首粒黑便时间均高于正常组，但与模型组比较存在显著差异(p<0.05)；而lp-cqpc02-fsm灌胃小鼠的首粒黑便时间显著(p<0.05)低于其它两种豆奶(u-fsm和lb-fsm)。

豆奶对活性炭诱导便秘小鼠小肠推进率的影响如表4所示，各组小鼠的小肠长度之间不存在显著差异，说明活性炭造模不会对小肠长度产生影响；模型组小鼠的小肠推进率最低，显著低于正常组(p<0.05)；而给予便秘小鼠u-fsm、lb-fsm和lp-cqpc02-fsm灌胃后，小肠推进率与模型组比较得到了显著提高(p<0.05)，其中lp-cqpc02-fsm组的小肠推进率最接近正常组，说明lp-cqpc02-fsm可以促进小肠蠕动，加快活性炭在小肠中的推动速度，减少活性炭在小肠中的滞留时间，从而对便秘起到一定的改善作用。

表4豆奶对活性炭诱导便秘小鼠小肠推进率的影响

^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

4、小肠组织病理学切片观察

取0.5cm左右的小鼠小肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行he染色，在光学显微镜下观察组织形态变化。

当小肠绒毛受到损伤后，肠道蠕动功能也会受到不同程度的影响，而肠道蠕动减慢是引起便秘的因素之一，所以小肠绒毛的完整性对评价便秘同样具有重要意义。各组小鼠小肠的组织病理学切片观察如图6所示，正常组小鼠的小肠绒毛排列整齐均一，不存在断裂或皱缩现象，而模型组小鼠的小肠绒毛出现严重断裂和皱缩，而且杯状细胞不完整；虽然lp-cqpc02-fsm组和u-fsm组、lb-fsm组的小肠绒毛也有一定程度的皱缩和断裂，但是小肠绒毛明显比模型组小鼠的小肠绒毛更为完整，而且lp-cqpc02-fsm组小鼠的小肠绒毛几乎与正常组小鼠的小肠绒毛形态一致。

5、血清中mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平测定

取小鼠血浆，于4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清，严格按照mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip的试剂盒说明，分别测定它们在血清中的水平。

各组小鼠血清mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平测定结果见表5，与其他四组相比，正常组小鼠血清中的mtl、gas、et、ache、sp和vip水平最高，ss水平最低；模型组则表现出相反的趋势，血清中的ss水平最高，mtl、gas、et、ache、sp和vip水平最低；与模型组相比，lp-cqpc02-fsm组小鼠血清中的mtl、gas、et、ache、sp和vip水平得到了显著提高(p<0.05)，ss水平显著降低(p<0.05)。

表5小鼠血清mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip水平(pg/ml)

^a-e表示各组之间存在显著差异(p<0.05)。

有研究报道，一些便秘患者的神经递质水平(如mtl、gas、et、ss、ache、sp和vip)会发生变化。mtl是近年来评估胃肠道蠕动的重要指标，多数学者认为mtl能促进胃肠道各个部位的运动，而mtl释放的减少会降低胃肠道蠕动。gas是一种重要的胃肠激素，它能促进胃液分泌、增加胃肠道的蠕动、加速胃排空，同时促进幽门括约肌松弛。et是一种多功能肽，在心血管和肠道功能中发挥重要作用。目前ach(乙酰胆碱)被认为是在肠道运动中起重要作用的两种神经递质之一，它们通过与其受体结合起到促进胃肠蠕动的作用。一般来说，ache水平与ach水平呈正相关。sp是胃肠运动神经元的兴奋性递质。它强烈促进消化道平滑肌的收缩，刺激小肠和结肠粘膜分泌水和电解质，并促进胃肠蠕动。vip能刺激肠的蠕动，从而促进胃肠运动。上述实验结果显示，模型组小鼠血清中的mtl、gas、et、ache、sp和vip水平显著低于正常组，而lp-cqpc02-fsm组能显著提高这些神经递质的水平，说明便秘的发生与mtl、gas、et、ache、sp和vip水平下降有关，而lp-cqpc02-fsm可以提高这些神经递质水平，起到缓解便秘的作用。

ss能抑制胃肠激素的释放，还可以降低胃排空速度，减少平滑肌收缩，所有这些都可能导致便秘。上述实验结果显示，模型组ss水平最高，而lp-cqpc02-fsm组的ss水平显著降低(p<0.05)，意味着lp-cqpc02-fsm对便秘有一定的改善作用。

6、小肠中c-kit、scf、trpv1、gdnf、aqp3和aqp9mrna表达水平测定

按照trizol(invitrogen公司)说明书提取小肠总rna，用超微量分光光度计测定总rna的纯度和浓度，将每个样本的rna浓度调整到同一水平(1μg/μl)。然后取1μg/μl的rna样品1μl，加入(oligo)primerdt1μl和无菌超纯水10μl，混合，65℃反应5min，再加入ribolockrnaseinhibitor1μl、100mmdntpmix2μl、5×reactionbuffer4μl和revertaidm-mu/vrt1μl，混匀，在42℃，60min和70℃，5min条件下合成cdna。接着对目标基因进行反转录和扩增(所用引物序列见表6)。反应条件为：95℃变性15min，60℃退火1h，95℃延伸15min，总共40个循环。以gapdh作为持家基因，通过2^-δδct计算目标基因的相对表达量。

表6引物序列

各组小鼠小肠中c-kit和scfmrna表达水平如图7所示，正常组小鼠小肠中c-kit和scfmrna表达最强，相反模型组表达最弱，豆奶处理可以上调小鼠小肠的c-kit和scf表达，且lp-cqpc02-fsm上调c-kit和scf表达的能力强于lb-fsm和u-fsm。

cajal细胞(icc)是一种特殊的间充质细胞，研究表明结肠icc数量、细胞形态学改变和细胞网络结构异常都会导致结肠蠕动速度变慢，进而可能导致慢传输型便秘。c-kit是icc特异性标志物之一，scf是c-kit受体的天然配体。研究发现便秘患者小肠中的icc密度下降，并表明icc的降低与乙状结肠中c-kit基因表达的下调以及c-kit蛋白和mrna表达的降低有关。上述实验结果显示，lp-cqpc02-fsm组小鼠小肠中的c-kit和scf蛋白质表达和mrna表达均显著升高(p<0.05)，表明lp-cqpc02-fsm处理可以增加便秘小鼠的icc数量。

各组小鼠小肠中trpv1和gdnfmrna表达水平如图8所示，正常组小鼠小肠的gdnf表达强度最强，trpv1表达最弱；诱导便秘后，模型组小鼠小肠的gdnf表达下降，trpv1表达增强；lp-cqpc02-fsm、lb-fsm和u-fsm均能上调便秘小鼠小肠的gdnf表达和下调trpv1表达，且lp-cqpc02-fsm上调与下调能力强于lb-fsm和u-fsm。

trpv1与排便密切相关，trpv1的激活可触发神经递质释放，导致肠运动障碍。trpv1表达的增加是肠损伤的重要表现，胃肠道疾病引起的肠道损伤能导致便秘患者trpv1表达增加。gdnf可调节神经节细胞的功能，有助于修复受损肠道并改善便秘。便秘与肠神经系统有关，导致肌肉紧张，胃肠运动削弱。调节trpv1和gdnf的表达水平是缓解便秘的重要机制之一。

各组小鼠小肠中aqp3和aqp9mrna表达水平如图9所示，正常组小鼠小肠的aqp3表达最弱，aqp9表达最强；诱导便秘后，模型组小鼠小肠的aqp9表达下降，而aqp3表达增强；lp-cqpc02-fsm、lb-fsm和u-fsm均能上调便秘小鼠小肠的aqp9表达和下调aqp3表达，且lp-cqpc02-fsm上调与下调能力强于lb-fsm和u-fsm。

aqp3在肠道中能促进结肠对肠内的水分进行过度吸收，使结肠黏膜大量吸收肠内的水分，导致肠道内干燥，导致便秘发生。而aqp9能促进结肠黏液分泌，保持肠黏膜润滑，使粪便便于排出，起到缓解便秘的作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆第二师范学院

<120>植物乳杆菌cqpc02及其在制备改善便秘的食品中的应用

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>植物乳杆菌cqpc02(lactobacillusplantarumcqpc02)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aagagctggcagaccgactca21

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ccggctttttgggaagggt19

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gagacaggtaggtccatccac21

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggggtatggagaagttggctag22

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ctatgagaatgctgccgaaaa21

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cctctggacacttggatatgat22

<210>13

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gggacggggttgttgtag18

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ctcctgattattgtcattgc20

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

atccaccagaagttgttt18

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

tgcaccaccaactgcttag19

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gatgcagggatgatgttc18