生姜茎基腐病群结腐霉的LAMP检测引物及检测方法与流程

文档序号:15457607发布日期:2018-09-15 01:34

本发明具体涉及一种生姜茎基腐病群结腐霉的LAMP检测引物及检测方法。



背景技术:

生姜是全球重要的辛香蔬菜,是我国优势特产蔬菜,单位面积效益居经济作物前列,已成为我国乡村振兴、扶贫攻坚的特色高效产业,重庆市七大特色产业链主推作物。然而,生姜田间病害突发频发,给生姜种植产业造成巨大经济损失。长江上游高温高湿、时晴时雨的气候和粘性的土壤适宜生姜病原菌的繁殖、传播。据调查,在每年的6-8月份,姜瘟病、茎基腐病等田间病害进入高发期,常常是一场雨一场病,轻者减产20%-30%,重者可达80%以上,且一旦大面积发病,很难采取措施补救,给姜农带来巨额损失。

现已查明,生姜病害主要有细菌性病害和真菌性病害,包括姜瘟病青枯菌(R.solanacearum)等4种细菌性病原菌和茎基腐病群结腐霉菌(Pythium myriotylum)等10余种真菌性病原菌。生姜病害在发病初期通常是单一病原菌引起,而病害症状显现后通常会混合多种病原菌,导致复合病症出现,给病原菌诊断带来极大的困难。茎腐病是生姜种植业最具破坏性的病害之一,具有发病时间短、病程进展快、病株致死率高的特点。近年来,随着分子生物学的飞速发展,为植物病害的早期检测鉴定提供了新的技术和方法,植物病原菌的诊断技术己从田间传统诊断、免疫学诊断发展到了以PCR为基础的植物病原菌的分子检测水平,但迄今为止针对生姜病原菌的田间分子检测技术尚未见到报到。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题之一,在于提供一种群结腐霉的LAMP检测引物。

本发明是这样实现的:一种群结腐霉的LAMP检测引物,其特征在于:包括三引物对:FIP、BIP;F3、B3;LF、LB;各引物的核苷酸序列如下:

FIP:5′-TCACTGCGTTCGAAAGTCAC-AGAAGACGCGAGTCCCT-3’

BIP:

5′-GATCGCTCTGCGCGAGTGG-CACCCCGTCAGCTGCAAA-3’;

F3:5′-GTGAGGTGTCTCGCTGGGT-3’;

B3:5′-GCCCCACACAAGACAGGTA-3’;

LF:5′-ACAAGAAAGAGCGAACG-3’;

LB:5′-AAGCAACCTCTATTGGCG-3’。

本发明要解决的技术问题之二,在于提供一种群结腐霉LAMP检测方法。

本发明是这样实现的:一种群结腐霉LAMP检测方法,利用权利要求1所述的LAMP引物进行LAMP反应,LAMP反应体系为:

反应总体积25μL,1.2μM FIP和BIP,0.4μM F3和B3,0.4μM LF和LB,2.0mM d NTPs,1.2M betaine,10mM Tris-HCl(pH 8.8),30mM KCl,5mM(NH4)2SO4,10mM MgSO4,0.15%Tween-20,10个单位的Bst 2.0 DNA大片段聚合酶,2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液,2μL DNA模板和1μL SYBR GreenI荧光染料;

反应条件:反应温度为56℃,反应时间30min,最后80℃热处理10min终止反应。

本发明的优点在于:建立了一种生姜病原菌田间分子快速诊断方法,病害检测时期可由传统的症状期提前到病菌潜伏期,有效地指导姜农对症下药,减少农药使用量。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

【具体实施方式】

本发明从重庆生姜种植区采集到生姜茎腐病病株,通过形态学观察、分子生物学和致病性鉴定,将病原菌鉴定为群结腐霉(Pythium myriotylum)。根据在ncbi中公布的其它来源Pythium myriotylum Its基因序列设计引物扩增到重庆来源的Pythium myriotylum Its基因序列,经比对序列发现,重庆来源的与其它来源的群结腐霉Its基因序列存在一定数量的点突变,重庆来源的群结腐霉序列如SEQ ID NO:1所示。

以群结腐霉的Its基因序列(如SEQ ID NO:2所示)作为检测靶标,通过比对分析后,利用Primer Explorer Version 4.0(http://primerexplorer.jp/e/)在线设计6条LAMP特异性引物,引物由生工生物工程技术服务有限公司合成。其中,Lamp引物如下:

FIP(F1c+F2):

5′-TCACTGCGTTCGAAAGTCAC-AGAAGACGCGAGTCCCT-3’

(SEQ ID NO:3);

BIP(B1c+B2):

5′-GATCGCTCTGCGCGAGTGG-CACCCCGTCAGCTGCAAA-3’

(SEQ ID NO:4);

F3:5′-GTGAGGTGTCTCGCTGGGT-3’(SEQ ID NO:5);

B3:5′-GCCCCACACAAGACAGGTA-3’(SEQ ID NO:6);

LF:5′-ACAAGAAAGAGCGAACG-3’(SEQ ID NO:7);

LB:5′-AAGCAACCTCTATTGGCG-3’(SEQ ID NO:8)。

一、群结腐霉DNA提取

将采集到的生姜茎腐病病株的根茎用自来水轻轻冲洗数遍后,剪成2cm左右的根段,用75%酒精表面消毒5min,无菌水冲洗3遍,再用95%次氯酸钠消毒2min,无菌水再冲洗3遍,最后用消毒的解剖刀切掉两端后,取0.2cm内部小段病组织,以研磨杵碾碎后悬浮于灭菌水中,10min后作为样品DNA模版。

二、群结腐霉LAMP检测方法

利用所述LAMP引物进行LAMP反应,LAMP反应体系为:

反应总体积25μL,1.2μM FIP和BIP,0.4μM F3和B3,0.4μM LF和LB,2.0mM d NTPs,1.2M betaine,10mM Tris-HCl(pH 8.8),30mM KCl,5mM(NH4)2SO4,10mM MgSO4,0.15%Tween-20,10个单位的Bst 2.0 DNA大片段聚合酶,2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液,2μL DNA模板和1μL SYBR Green I荧光染料;

反应条件:反应温度为56℃,反应时间30min,最后80℃热处理10min终止反应。

三、LAMP反应结果:

LAMP反应特异性检测

分别以群结腐霉和非群结腐霉(参照组)的DNA为模板进行LAMP扩增反应,反应结束后观察各反应管中颜色变化,其中群结腐霉的反应管中反应液均呈现绿色,表明有大量目的DNA进行了扩增。而其它参照组及阴性对照的反应液均保持橙色不变,表明本发明上述6条引物不能使它们发生扩增反应,且该检测过程未出现假阳性。通过ABI 7500 Real Time PCR实时观测反应过程,LAMP对病原菌的检测灵敏度为5.1×102CFU/mL,且不受组织提取液的干扰,较常规PCR提高100倍。对田间收集生姜病株样品进行检测,能够准确的识别靶标病原菌茎基腐病群结腐霉和干扰菌。检出时间由利用传统柯赫氏法则检测需要的7天缩短至1h以内,准确率99%以上,表明该方法可用于田间生姜茎基腐病病株的诊断。

LAMP方法灵敏度检测

以提取的重庆来源群结腐霉的DNA原液及10倍梯度稀释后的稀释液为模板进行LAMP检测和常规PCR检测,琼脂糖凝胶电泳结果显示如图1所示,常规PCR在浓度为105倍的稀释模板下无明显扩增反应,表明其最低检测浓度为160pg。荧光染料法结果显示,LAMP反应在浓度为106倍的稀释模板下无明显扩增反应,表明其最低检测浓度为16pg。可见,LAMP的检测灵敏度相对于常规PCR检测方法提高10倍。

其中,PCR反应根据群结腐霉的Its部分序列设计引物进行扩增,扩增引物为:

itsF 5′-TGGGAATTGCAGAATTCAGTG-3′(SEQ ID NO:9);

itsR 5′-GTATGT TAGGCTTCGG GCC-3′(SEQ ID NO:10);

扩增长度342bp,反应体系:反应总体积25μL,12.5μL Premix Taq Hot Start Version(PCR Buffer;TaKaRa Taq HS,1.25U;250μM d NTP;Tris-HCl(pH 8.9),10mM;KCl,50mM,MgCl2,1.5mM)、F/R引物各0.5μM,DNA提取液1μL。

反应程序为:94℃预变性2min;98℃变性10sec;56℃退火30sec;72℃延伸30sec;30Cycles。

本发明基于ITS基因序列设计特异识别茎基腐病群结腐霉等病原菌的引物,利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立生姜病原菌田间分子快速诊断方法,病害检测时期可由传统的症状期提前到病菌潜伏期,有效地指导姜农对症下药,减少农药使用量。

<110> 重庆文理学院

<120> 生姜茎基腐病群结腐霉的LAMP检测引物及检测方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1726

<212> DNA

<213> 群结腐霉( Pythium myriotylum)

<400> 1

ggtagcttcc gtagctgaac ctgcggaaac gatcattacc acaccataaa aagtttccca 60

ccatcgaagg catcgacttg gacgcctttg ctagtaatgg tgtggtattt ttcaaagggt 120

cgtgaaccgt tacaattatg ttgtgtgcct tctctcgggg aggcagaacg aaggtgggct 180

gcacttggca atgttaatac aacacacgga agagagcccc tccgtcttgc ttccacccga 240

gctgttatgg cggactgccg atgtactttt caaacccatt taacttatac tgaactatac 300

cgacaatacc gcctgacggc tacatgaaaa gtttgggtaa attgaatatg acttgatatg 360

tccgagaacg aaagttttag gttttaatcc ataacaactt tcagcagtgc atgtctaggc 420

aggctcttgc tttcaaaatc caaaattagg tattgttgaa agtcgtcacg tacagatccg 480

tcgcacatcg atgaagaacg ctgcgaactg cgatacgtaa tgggaattgc agaattcagt 540

agcgtgtagc tacttcttgc gacgcttgac gctatgcatt acccttaacg tcttaagtca 600

gagtcatcga aattttgaac gcacattgca ctttcgggtt atgcctggaa gtatgcttgt 660

ctcagtagct ttaaaacttg cgtgtaacgt gaaagcccaa tacggacctt catacgaaca 720

atcagtgtcc gtacatcaaa catgcctttc tttttttgtg tagtctagat tagagatggc 780

tagtcacagg catgtagttt gtacggaaag aaaaaaacac atcagatcta atctctaccg 840

agaatgtgag gtgtctcgct gggtccctct tcggaggaga agacgcgagt ccctttaaat 900

tcttacactc cacagagcga cccagggaga agcctcctct tctgcgctca gggaaattta 960

gtacgttcgc tctttcttgt gtctaagatg aagtgtgact ttcgaacgca gtgatctgtt 1020

catgcaagcg agaaagaaca cagattctac ttcacactga aagcttgcgt cactagacaa 1080

tggatcgctc tgcgcgagtg ggcgacttcg gttaggacat taaaggaagc aacctctatt 1140

acctagcgag acgcgctcac ccgctgaagc caatcctgta atttccttcg ttggagataa 1200

ggcggtatgt taggcttcgg gccgactttg cagctgacgg ggtgttgttt tctgttcttt 1260

ccgccataca atccgaagcc cggctgaaac gtcgactgcc ccacaacaaa agacaagaaa 1320

ccttgaggtg tacctgtctt gtgtggggca atggtctggg caaatggttg ttgagtagta 1380

ggaactccac atggacagaa cacaccccgt taccagaccc gtttaccaac aactcatcat 1440

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<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 群结腐霉Its基因序列( Pythium myriotylum)

<400> 2

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<213> (人工序列)

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<211> 37

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<213> (人工序列)

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<213> (人工序列)

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<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> (人工序列)

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gtatgttagg cttcgggcc 19

再多了解一些
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