肾透明细胞癌的诊断标志物-C16orf74基因的制作方法

文档序号:15457568发布日期:2018-09-15 01:33

本发明属于生物医学领域,涉及一种肾透明细胞癌的诊断标志物,具体涉及C16orf74基因在诊断肾透明细胞癌中的用途。



背景技术:

肾癌(renal cell carcinoma,RCC)又称肾细胞癌、肾腺癌、肾上腺样瘤等,是最常见的肾实质恶性肿瘤,占人类全身恶性肿瘤的3%,其发病率居泌尿系恶性肿瘤的第二位。RCC的发病率在欧美国家呈一种逐年上升的趋势,据统计美国每年新增约30,000RCC患者,每年约12,000人死于RCC相关疾病。肾癌发病率男女之比约为3.5:1,常于40岁以后发生,偶有30岁以下者。肾癌常起源于近曲小管上皮细胞,近期研究表明,远曲小管和集合管也可能发生肾癌。

肾癌具有组织多样性,发病机制尚不清楚,恶性程度高,不易早期发现,确诊时约35%的患者已有转移,约40%患者术后转移或复发,3年存活率小于5%。肾癌一旦出现淋巴转移,即使行根治性淋巴结清扫,患者生存期也极少超过5年,若出现肝肺转移或邻近脏器浸润预后则更差。肾癌按病理类型可分为透明细胞癌(75%),I型乳头状肾癌((5%),II型乳头状肾癌(10%)、嫌色细胞癌(5%)和集合管癌(5%),此外尚有1%左右的未分类肾细胞癌。不同病理类型的肾癌具有不同的临床特点、治疗方案和预后。

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常见的一种肾细胞癌。肿瘤外形常不规则,切面多为黄色,也可有灰色或白色,黄色一般为细胞分化良好,灰色可能为分化不良或未分化肿瘤。肿瘤常为实性,单侧单发病灶。显微镜下呈圆形或多角形,胞浆丰富,内含大量糖元、磷脂和中性脂肪,这些物质在切片制作过程中被溶质溶解,呈透明状。cc-RCC同其它类型的RCC一样,对放、化疗及激素治疗均不敏感,免疫治疗效果也不理想,近年来晚期肾癌的生物靶向治疗取得了一定的进展,但疗效仍很有限。目前的主要治疗手段仍是手术切除,对于体积较小、分化良好无转移的早期cc-RCC外科治疗5年存活率可达90%;但一旦出现转移,5年生存率不足10%。所以,cc-RCC的早期诊断非常重要,近年来发现微小RNA(microRNA,miRNA)与肿瘤的发病关系密切,有可能成为一种潜在的早期诊断和晚期治疗的新途径。

肾细胞癌病因和发病机制迄今为止不明。目前认为可能与吸烟、使用含非那西汀的止痛剂、砷化学制剂、肾结石病史、感染、肾透析、高血压病、药利尿剂的长期使用、职业暴露于化学物质、放射线及肥胖等因素有关。当前研究表明,肾细胞癌的发生、发展是一个多因素、多基因异常及多阶段的过程,发病机制极为复杂。积极探索肾细胞癌新的相关基因有助于揭示肾细胞癌发生的分子机制,并为肾细胞癌诊治提供新的线索和策略。



技术实现要素:

本发明的目的之一在于提供一种通过检测C16orf 74基因或蛋白的表达差异来诊断肾透明细胞癌的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过抑制C16orf74基因或C16orf74蛋白来治疗肾透明细胞癌的方法。

本发明的目的之三在于提供一种用于筛选肾透明细胞癌治疗药物的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于治疗肾透明细胞癌的药物。

为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:

本发明提供了检测C16orf74的产品在制备肾透明细胞癌诊断工具中的应用。

进一步,所述检测C16orf74的产品包括检测C16orf74基因表达量的产品。

更进一步,所述检测C16orf74的产品包括能够定量C16orf74基因mRNA的产品,和/或能够定量C16orf74蛋白的产品。

本发明的定量C16orf74基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能:如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得,或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因,然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步,所述PCR方法为已知方法,例如,ARMS(Amplification Refractory Mutation System,扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

所述能够定量C16orf74基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增C16orf74基因的引物,所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备,通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计,并通过化学合成来制备。

上面所述的核酸还可包括探针,所述探针可以通过化学合成来制备,通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计,并通过化学合成来制备,或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因,并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的定量C16orf74蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能:例如,可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量C16orf74蛋白的产品包括特异性结合C16orf74蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段,只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量C16orf74蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸,包含该核酸的载体,和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如,制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后,从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的C16orf74蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对C16orf74蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体:用与上文相同的抗原免疫动物,从经过免疫的动物收集血液样品,从血液中分离出血清,然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如,可以如下荧光标记蛋白质或肽:用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽,添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料,然后混合溶液,再于室温放置10分钟。另外,标记可使用商品化的标记试剂盒,诸如生物素标记试剂盒,如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories);碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2,B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories);荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记,可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品,可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制,只要它适于本发明的测定;例如,它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中,所述样品来自受试者的组织。本领域技术人员公知,肿瘤组织的细胞会脱落到体液中,这些脱落的细胞称之为循环肿瘤细胞,循环肿瘤细胞的性质同肿瘤组织中肿瘤细胞的性质相同,因此检测体液中尤其是血液中循环肿瘤细胞的性质就可以代表肿瘤组织的性质。就本发明而言,通过检测肿瘤组织中C16orf74基因表达可以用于诊断肾透明细胞癌,可以容易得出也可以通过检测循环肿瘤细胞中C16orf74基因表达来诊断肾透明细胞癌。

进一步,所述定量C16orf74基因或C16orf74蛋白的产品可以是检测C16orf74基因或C16orf74蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等,也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断肾透明细胞癌的工具,所述工具能够检测C16orf74基因表达量。

进一步,所述工具包括包括能够定量C16orf74基因mRNA的试剂,和/或能够定量C16orf74蛋白的试剂。

更进一步,所述能够定量C16orf74基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增C16orf74基因的引物,所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步,所述诊断肾透明细胞癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台;高通量测序平台是一种特殊的诊断肾透明细胞癌的工具,随着高通量测序技术的发展,对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱,容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此,在高通量测序中获知C16orf74基因的异常与肾透明细胞癌相关也属于C16orf74的用途,同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗C16orf74抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制,只要抗体能够结合C16orf74即可。

本发明还提供了一种诊断肾透明细胞癌的方法,所述方法包括如下步骤:

(1)获取受试者的样品;

(2)检测受试者样品中C16orf74基因或蛋白的表达水平;

(3)将测得的C16orf74基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比,C16orf74基因或蛋白的表达水平升高,则该受试者被判断患有肾透明细胞癌或者具有患有肾透明细胞癌的风险、或者肾透明细胞癌患者被判断为复发、或者肾透明细胞癌患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种肾透明细胞癌的治疗方法,所述方法包括抑制C16orf74基因或C16orf74蛋白。

进一步,所述方法包括抑制C16orf74基因的表达,或抑制C16orf74蛋白的表达或抑制C16orf74蛋白的活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法,可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量C16orf74基因或者

C16orf74蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说,当C16orf74基因或者C16orf74蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时,可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

本发明还提供了一种治疗肾透明细胞癌的药物,所述药物包含抑制C16orf74表达的试剂。

本发明的抑制C16orf74表达的试剂不受限制,只要所述试剂能够抑制C16orf74或涉及C16orf74上游或下游途径的物质的表达或活性,且对于治疗肿瘤有效的药物即可。

本发明还提供了C16orf74基因或C16orf74蛋白在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。

本发明还提供了上述试剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。

进一步,所述试剂包括针对C16orf74基因表达的干扰RNA,或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的抑制试剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分,加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂,这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油,诸如此类,各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中,这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味,在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式,或任选地使用其药物学可接受的盐的形式,本发明的抑制试剂可以单独给药,或以各种组合给药,以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制试剂进行给药。使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明的抑制试剂施用于人,其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于,经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制,只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可,包括但不限于静脉内,腹膜内,眼内,动脉内,肺内,口服,小泡内,肌肉内,气管内,皮下的,通过皮肤,通过胸膜,局部的,吸入,通过粘膜,皮肤,肠胃,关节内,心室内,直肠,阴道,颅骨内,尿道内,肝内,瘤内。在某些情况下,可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制,只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可,可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中,“诊断肾透明细胞癌”包括判断受试者是否已经患有肾透明细胞癌、判断受试者是否存在患有肾透明细胞癌的风险、判断肾透明细胞癌患者是否已经复发与转移、判断肾透明细胞癌患者对药物治疗的反应性、或者判断肾透明细胞癌患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态,并且包括:

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生,尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态,但尚未被诊断出患有这种疾病状态时;

(2)抑制疾病或疾病状态,即阻止其发生;或者

(3)缓解疾病或疾病状态,即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如,被兽医所应用),其中可达到某些预期的治疗效果,例如,抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途,也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果:

本发明的发现了一种诊断肾透明细胞癌的分子标志物,使用该分子标志物可以在肾透明细胞癌发生的早期即可作为判断,提供了患者的生存率。

本发明的包括C16orf74基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的肾透明细胞癌的治疗药物。

附图说明

图1显示利用QPCR检测C16orf74基因在肾透明细胞癌组织与正常组织中的差异表达。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选肾透明细胞癌组织中差异表达基因

1、样本收集

5例均为医院泌尿外科收治的ccRCC患者。3例癌组织标本均为行肾癌根治术后0.5h内置于液氮罐冻存备用,2例正常肾组织标本取自T1肾癌距原发灶5cm以上的正常区域肾组织。所有标本均经常规病理检查证实,实验前再次由医院病理科复核。实验标本的留取均获患者或家属同意。

2、样本总RNA提取

分别取上述各组织样品约50-100mg,加Trizol提取总RNA,采用Beckman DU530紫外分光光度仪测定样品的浓度及纯度,然后采用Agilent BioAnalyzer 2100进行RNA样品的质量鉴定。

3、测序

采用Solexa测序技术对样品进行测序。

4、数据分析

4.1原始数据处理

测序仪产生的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据,我们称之为原始序列数据,结果以FASTQ文件格式存储。由于原始序列数据可能包含低质量序列、接头序列等杂质序列数据,不能直接用于生物信息分析,所以原始序列数据必需经过数据处理转换为高质量序列数据,利用Tophat(version:2.0.6)软件的spliced mapping算法对高质量序列数据进行基因组比对,采用基因组版本为Sscrofa10.2。

4.2差异基因的筛选

基因表达量的计算使FPKM法。根据基因的表达量(FPKM值)计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。差异表达基因定义为FDR≤0.01且倍数差异在2倍及以上的基因。

5、结果

肾透明细胞癌组织和正常肾组织之间筛选出1324个差异表达基因,其中,750个基因表达上调,574个基因表达下调。

实施例2差异表达基因在大样本中的验证

选择高通量测序提示在肾透明细胞癌组织和正常肾组织之间差异表达的C16orf74基因为研究目标进行大样本验证。

1、组织获取和处理:按照实施例1的方法收集肾透明细胞癌组织45例,正常肾组织45例。

2、RNA提取

按照实施例1的方法进行RNA提取。

3、逆转录合成cDNA

各取总RNA 2μg,加入5μl T7启动子引物,加无核酸酶水至总的反应体积为11.5μl,65℃水浴10min,冰上放置5min,然后加8.5μl cDNA Master Mix(含5x第一链缓冲液4μl,0.1mol/L DTT 2mol/L。10mol/L dNTP混合物1μl,逆转录酶MMLV 1μl,RNA酶抑制剂0.5μl,40℃水浴2h后,65℃15min灭活MMLV,冰上孵育5min。

4、实时定量PCR

采用25μl反应体系,每个样本设置3个平行管。

配制以下反应体系:SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl,正向引物(5μM)1μl,反向引物(5μM)1μl,模板cDNA2.0μl,无酶水8.5μl;各项操作均于冰上进行。

扩增程序为:95℃5min,(95℃5s,60℃56s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。

引物设计

C16orf74基因:

正向引物序列为5’-AAAGGCTTTCAAATGTGTGTC-3’(SEQ ID NO.1),反向引物序列为5’-CAGGTGCTTGTCGTTCAG-3’(SEQ ID NO.2);

GAPDH基因:

正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3),反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。

6、结果

与正常肾组织相比,45例肾透明细胞癌组织中41例的癌组织中C16orf74基因mRNA水平显著升高,2例的癌组织中C16orf74基因mRNA水平基本无变化,剩余2例的癌组织中C16orf74基因mRNA水平稍有下调。统计结果如图1所示,与正常肾组织相比,肾透明细胞癌组织中C16orf74基因mRNA水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> 肾透明细胞癌的诊断标志物-C16orf74基因

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaggctttc aaatgtgtgt c 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcttg tcgttcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttccaat atgattcca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttccatt gatgacaag 19

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