本发明涉及中药制药
技术领域：
，具体涉及一种重楼皂苷h的制备方法及其在治疗胃肠炎中的应用。
背景技术：
肠胃炎是胃黏膜和肠黏膜发炎，由食物中毒引起。肠胃炎是夏秋季的常见病、多发病。多由于细菌及病毒等感染所致。主要表现为上消化道病状及程度不等的腹泻和腹部不适，随后出现电解质和液体的丢失，属于中医“呕吐、腹痛、泻泄”等病症范畴重搂系百合科(lilliaccae)重楼属(paris)多种植物的根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，现代药理研究其更具有抗肿瘤，止血、抗炎等药理活性，其活性成分为重楼总皂苷。主要分布在我国云南、广西、四川等地。萧梅芳等人探讨了重楼皂苷i在体外对人肝癌smmc-7721细胞株增殖和凋亡的影响及相关机制。研究显示，重楼皂苷i能时间和浓度依赖性的抑制肝癌smmc-7721细胞的增殖，可能是重楼皂苷i通过阻滞肿瘤细胞的生长及诱导细胞凋亡等机制，从而抑制肝癌细胞的增殖。(萧梅芳等，重楼皂苷i对肝癌细胞的增殖及凋亡的影响.生命科学研究.2011，15(6)：519)50μmol/l重楼皂苷ⅱ溶液在体外可以抑制狼疮性肾炎局部免疫反应，可能是通过提高淋巴细胞内tgf-β蛋白和il-10蛋白的表达量来调节th1/th2失衡，进而提高cd4+cd25+treg的免疫抑制作用(王娟等，重楼皂甙ⅱ对狼疮性肾炎患者外周血cd4+cd25+t调节细胞表达的细胞因子的影响.2010，10(1)：50)。重楼皂苷h(pennogenin-3-o-[α-l-arabinofuranose(1→4)]-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-glucopyranoside，parg)，是一类重要的甾体皂苷，也是重楼中主要功效成分之一，具有明确止血消炎和治疗胃肠炎的活性。重楼制剂宫血宁(含有重楼皂苷h)能有效治疗各型子宫出血症，治愈率为95.3％，且治疗效果随剂量的增加而愈加显著。但目前，将重楼皂苷h应用到治疗胃肠炎的药物中鲜有报道。在重楼皂苷的提取方面目前多以重楼总皂苷或几种皂苷混合物的提取为主，功效成分不确定，且存在提取技术烦琐，效率低且纯度不高等问题。苗药重楼和土木香以及藏药芫巫果和紫硇盐在治疗胃肠炎中具有明显的效果，将其与其他中药复配，制得的中药组合物，在治疗急性和慢性胃肠炎中均有良好的疗效。其中，重楼止血消炎、土木香健脾胃、芫巫果和紫硇盐消炎及促进胃动力，增强食欲，与其他几味中药材复方配合组药，功效更佳。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明提供一种重楼皂苷h的的制备方法及其在治疗胃肠炎中的应用，其目的在于，提供一种重楼皂苷h的的制备方法，通过酶解，超声波辅助半仿生提取液提取，得到的重楼皂苷h纯度高(可达到98％以上)，得率高(90-95％)，且方法简便，不需要苛刻的实验条件，成本低，易于实现工业化应用。本发明提供一种重楼皂苷h的的制备方法，按照以下方法制备：步骤一、准确称取重楼粗粉，加入一定量纤维素酶，加一定体积的缓冲溶液，50℃水浴加热，酶解一定时间后，高温灭活5min，用ph＝6.0-7.5的半仿生提取液在37℃、超声波辅助下提取，冷却后过滤，合并滤液，50℃水浴加热浓缩，与硅胶混合，得重楼硅胶粉；步骤二、将步骤一制备的重楼硅胶粉上硅胶柱，用氯仿和甲醇的混合液对产物进行洗脱，得到洗脱产物，将得到的洗脱产物进行薄层层析，在紫外光下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，找出并提取含有重楼皂苷h的粗样，合并相同样，得重楼皂苷h粗样，减压浓缩，得到重楼皂苷h浓缩粗样；步骤三、将步骤三制备的重楼皂苷h浓缩粗样上反相硅胶柱，用甲醇溶液对所述重楼皂苷h浓缩粗样洗脱，继续进行薄层层析，在紫外光下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，将与重楼皂苷h的标样相同的斑点且在荧光下观察无其他杂质的样品合并，得含有所述重楼皂苷h的纯化产物的甲醇溶液，该溶液用石油醚脱脂后，乙酸乙酯-乙酸丁酯萃取，减压浓缩除去溶剂，即得重楼皂苷h。作为本发明进一步的改进，重楼皂苷h的纯度为98％以上，所述重楼皂苷h的得率为90％-95％。作为本发明进一步的改进，半仿生提取液由0.2％氯化钠、0.32％胃蛋白酶及0.02mol/l盐酸配制而成。作为本发明进一步的改进，步骤一中所述缓冲溶液为ph＝4.5的naac-hac缓冲溶液；所述重楼粗粉的粒经数在40-60目之间；所述重楼粗粉与缓冲溶液的固液比为1：(15-25)。作为本发明进一步的改进，步骤一中所述酶解时间为100-150min；所述酶用量为(20-35)u/g底物。作为本发明进一步的改进，步骤一中所述硅胶为100-200目。作为本发明进一步的改进，步骤一中所述超声功率为500-700w，超声时间为30-60min。作为本发明进一步的改进，步骤二中所述硅胶为200-300目；所述洗脱为梯度洗脱；所述氯仿和甲醇的配比依次为100:1、30:1、20:1、10:1、1:1。作为本发明进一步的改进，步骤三中所述洗脱为梯度洗脱；所述甲醇溶液的质量分数依次为75％、85％和100％，所述乙酸乙酯-乙酸丁酯的体积比为(1-5)：1。作为本发明进一步的改进，步骤二和步骤三中所述紫外光为254nm。本发明进一步保护一种治疗胃肠炎的中药组合物，所述组合物由包括以下重量份的原料制备而成：重楼皂苷h25份；土木香22份；青叶线蕨17份；玉叶金花15份；海螵蛸15份；玉竹13份；芫巫果12份；紫硇盐10份；沙橘10份；车前子7份；大黄6份；玉米须5份。本发明进一步保护上述一种治疗胃肠炎的中药组合物的制备方法，按照以下步骤制备：步骤一、取土木香、青叶线蕨、玉叶金花、海螵蛸、玉竹、芫巫果、紫硇盐、沙橘、车前子、大黄、玉米须晒干，粉碎后混合，加入5-10倍体积水，浸泡1-1.5h，煎煮100-200min，减压过滤，滤液备用；步骤二、将步骤一所得药渣中加入3-6倍体积水，煎煮60-120min，减压过滤，滤液备用；步骤三、将步骤一和步骤二所得滤液合并，过400目筛，加入重楼皂苷h，搅拌均匀，浓缩滤液至相对密度1.2-1.7，添加辅料，制备成常规剂型。作为本发明进一步的改进，。本发明进一步保护上述一种的的应用。本发明具有如下有益效果：1.本发明制备得到的重楼皂苷h纯度高(可达到98％以上)，得率高，且方法简便，不需要苛刻的实验条件，成本低，易于实现工业化应用；2.重楼皂苷h具有明确止血消炎和治疗胃肠炎的活性，能够散寒消食、破瘀消积，用于慢性肠胃肠炎，胃出血，与土木香、青叶线蕨、玉叶金花、海螵蛸、玉竹、芫巫果、紫硇盐、沙橘、车前子、大黄、玉米须复配组方，对急性和慢性胃肠炎、胃冷痛、消化不良、食欲不振、呕吐泄泻、发热等疾病具有良好的治疗效果；3.本发明组分均采用天然的中药原料，且配制简便、药源广，治疗胃肠炎效果显著，疗程短，成本低，且无毒副作用。附图说明图1为重楼皂苷h的制备工艺图；图2为重楼皂苷h的液相色谱图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。实施例1重楼皂苷h的制备按照以下方法制备：步骤一、准确称取40目重楼粗粉，加入20u/g底物的纤维素酶，加ph＝4.5的naac-hac缓冲溶液(固液比1:15)，50℃水浴加热，酶解100min后，高温灭活5min，用ph＝6.0的半仿生提取液(由0.2％氯化钠、0.32％胃蛋白酶及0.02mol/l盐酸配制而成)在37℃、500w超声波辅助下提取30min，冷却后过滤，合并滤液，50℃水浴加热浓缩，与100-200目硅胶混合，得重楼硅胶粉；步骤二、将步骤一制备的重楼硅胶粉上硅胶柱(硅胶为200-300目)，用氯仿和甲醇的混合液对产物进行梯度洗脱，氯仿和甲醇的配比依次为100:1、30:1、20:1、10:1、1:1，得到洗脱产物，将得到的洗脱产物进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，找出并提取含有重楼皂苷h的粗样，合并相同样，得重楼皂苷h粗样，减压浓缩，得到重楼皂苷h浓缩粗样；步骤三、将步骤三制备的重楼皂苷h浓缩粗样上反相硅胶柱，用甲醇溶液对重楼皂苷h浓缩粗样梯度洗脱，甲醇溶液的质量分数依次为75％、85％和100％，继续进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，将与重楼皂苷h的标样相同的斑点且在荧光下观察无其他杂质的样品合并，得含有重楼皂苷h的纯化产物的甲醇溶液，该溶液用石油醚脱脂后，乙酸乙酯-乙酸丁酯(体积比1:1)萃取，减压浓缩除去溶剂，即得重楼皂苷h，得率95％。实施例2重楼皂苷h的制备按照以下方法制备：步骤一、准确称取60目重楼粗粉，加入35u/g底物的纤维素酶，加ph＝4.5的naac-hac缓冲溶液(固液比1:25)，50℃水浴加热，酶解150min后，高温灭活5min，用ph＝7.5的半仿生提取液(由0.2％氯化钠、0.32％胃蛋白酶及0.02mol/l盐酸配制而成)在37℃、700w超声波辅助下提取60min，冷却后过滤，合并滤液，50℃水浴加热浓缩，与100-200目硅胶混合，得重楼硅胶粉；步骤二、将步骤一制备的重楼硅胶粉上硅胶柱(硅胶为200-300目)，用氯仿和甲醇的混合液对产物进行梯度洗脱，氯仿和甲醇的配比依次为100:1、30:1、20:1、10:1、1:1，得到洗脱产物，将得到的洗脱产物进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，找出并提取含有重楼皂苷h的粗样，合并相同样，得重楼皂苷h粗样，减压浓缩，得到重楼皂苷h浓缩粗样；步骤三、将步骤三制备的重楼皂苷h浓缩粗样上反相硅胶柱，用甲醇溶液对重楼皂苷h浓缩粗样梯度洗脱，甲醇溶液的质量分数依次为75％、85％和100％，继续进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，将与重楼皂苷h的标样相同的斑点且在荧光下观察无其他杂质的样品合并，得含有重楼皂苷h的纯化产物的甲醇溶液，该溶液用石油醚脱脂后，乙酸乙酯-乙酸丁酯(体积比5:1)萃取，减压浓缩除去溶剂，即得重楼皂苷h，得率95％。实施例3重楼皂苷h的制备按照以下方法制备：步骤一、准确称取40目重楼粗粉，加入30u/g底物的纤维素酶，加ph＝4.5的naac-hac缓冲溶液(固液比1:15)，50℃水浴加热，酶解120min后，高温灭活5min，用ph＝6.5的半仿生提取液(由0.2％氯化钠、0.32％胃蛋白酶及0.02mol/l盐酸配制而成)在37℃、600w超声波辅助下提取50min，冷却后过滤，合并滤液，50℃水浴加热浓缩，与100-200目硅胶混合，得重楼硅胶粉；步骤二、将步骤一制备的重楼硅胶粉上硅胶柱(硅胶为200-300目)，用氯仿和甲醇的混合液对产物进行梯度洗脱，氯仿和甲醇的配比依次为100:1、30:1、20:1、10:1、1:1，得到洗脱产物，将得到的洗脱产物进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，找出并提取含有重楼皂苷h的粗样，合并相同样，得重楼皂苷h粗样，减压浓缩，得到重楼皂苷h浓缩粗样；步骤三、将步骤三制备的重楼皂苷h浓缩粗样上反相硅胶柱，用甲醇溶液对重楼皂苷h浓缩粗样梯度洗脱，甲醇溶液的质量分数依次为75％、85％和100％，继续进行薄层层析，在紫外光(254nm)下观察显色，与重楼皂苷h的标样对比，将与重楼皂苷h的标样相同的斑点且在荧光下观察无其他杂质的样品合并，得含有重楼皂苷h的纯化产物的甲醇溶液，该溶液用石油醚脱脂后，乙酸乙酯-乙酸丁酯(体积比3:1)萃取，减压浓缩除去溶剂，即得重楼皂苷h，得率90％。实施例4一种治疗胃肠炎的中药组合物的制备原料组成：重楼皂苷h25份；土木香22份；青叶线蕨17份；玉叶金花15份；海螵蛸15份；玉竹13份；芫巫果12份；紫硇盐10份；沙橘10份；车前子7份；大黄6份；玉米须5份。制备方法：步骤一、取土木香、青叶线蕨、玉叶金花、海螵蛸、玉竹、芫巫果、紫硇盐、沙橘、车前子、大黄、玉米须晒干，粉碎后混合，加入5倍体积水，浸泡1h，煎煮100min，减压过滤，滤液备用；步骤二、将步骤一所得药渣中加入3倍体积水，煎煮60min，减压过滤，滤液备用；步骤三、将步骤一和步骤二所得滤液合并，过400目筛，加入重楼皂苷h，搅拌均匀，浓缩滤液至相对密度1.7，添加麦芽糊精，喷雾干燥，制备固体药粉。实施例4一种不含重楼皂苷h的治疗胃肠炎的中药组合物的制备原料组成：土木香22份；青叶线蕨17份；玉叶金花15份；海螵蛸15份；玉竹13份；芫巫果12份；紫硇盐10份；沙橘10份；车前子7份；大黄6份；玉米须5份。制备方法：步骤一、取土木香、青叶线蕨、玉叶金花、海螵蛸、玉竹、芫巫果、紫硇盐、沙橘、车前子、大黄、玉米须晒干，粉碎后混合，加入10倍体积水，浸泡1.5h，煎煮200min，减压过滤，滤液备用；步骤二、将步骤一所得药渣中加入6倍体积水，煎煮120min，减压过滤，滤液备用；步骤三、将步骤一和步骤二所得滤液合并，过400目筛，搅拌均匀，浓缩滤液至相对密度1.2，添加麦芽糊精，喷雾干燥，制备不含重楼皂苷h的固体药粉。测试例1重楼皂苷h的鉴定将实施例1制备得到的重楼皂苷h置于氘代氯仿中进行核磁共振波普检测，其结果为：esi-ms给出准分子离子峰m/z：869[m-h]-；结合1hnmr、13cnmr推出其分子式为c44h70o17。1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ：0.79(3h,d,j＝7.2hz，h-27)，0.73(3h,s,h-18)，0.95(3h,s,h-19),1.09(3h,d,j＝6.0hz,h-21),1.15(3h,d,j-6.2hz,rhah-6)，3.21(2h，m,h-26),3.66(1h,m,h-3),4.43(1h,d,j-8.0。hz,gluh-1),4.88(1h,d,j＝1.7hz，arah-1),5.03(1h,d,j＝1.2hz,rhah-1),5.34(1h,br,h-6)。13cnmr鉴定结果为糖苷配基位1-27号化学位移为：37.2、30.0、76.7、38.9、140.6、121.8、31.9、31.2、49.9、36.7、20.4、31.944.9、52.3、31.9、89.4、89.3、17.0、19.3、44.0、9.7、109.1、31.7、28.4、29.4、66.3、17.5；置糖的位置1-20位数化学位移为：98.4、76.6、76.2、75.2、76.2、61.6、rha2、100.5、70.8、68.3、72.1、66.2、18.1、ara3、108.1、81.6、76.8、84.6、60.3。对该化合物进行原位水解，tlc上检出有葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖存在。进一步结合文献报道，确定化合物5的结构为：重楼皂苷h，分子结构式为pennogenin-3-o-[α-l-arabinofuranose(1→4)]-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-glucopyranoside。测试例2重楼皂苷h的纯度测试取实施例1制备得到的重楼皂苷h，加入到高效液相色谱中，其中色谱条件为inertsilods-3c18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-水(50∶50)；检测波长为203nm；流速为1.0ml·min-1；柱温为35℃；进样量为20.0μl。利用面积归一化法计算长重楼皂苷h的纯度大于98.5％，液相色谱图见附图2。本发明为重楼中重楼皂苷h的提取提供了新的思路。测试例3临床实验1、实验组别。分为5组，分别为重楼皂苷h治疗组(1组)、中药组合物治疗组(2组)、无重楼皂苷h中药组合物治疗组(3组)、奥美拉唑治疗组(对照组)和空白组。2、实验方法。(1)病例选择。取广西省中医药大学第一附属医院2017年2月-2018年2月收治的门诊患者100例，每组20例。1组：男10例，女10例，年龄22～56岁，平均37岁，病程1～20个月，其中呕吐6例，腹泻腹痛6例，发热8例；2组：男11例，女9例，年龄20～53岁，平均35岁，病程3～20个月，其中呕吐7例，腹泻腹痛4例，发热9例；3组：男8例，女12例，年龄21～57岁，平均36岁，病程2～20个月，其中呕吐5例，腹泻腹痛6例，发热9例；对照组：男10例，女10例，年龄19～57岁，平均36岁，病程2～22个月，其中呕吐8例，腹泻腹痛6例，发热6例；空白组：男9例，女11例，年龄20～57岁，平均35岁，病程3～20个月，其中呕吐6例，腹泻腹痛8例，发热6例。(2)治疗方法。1组患者口服实施例1制备的重楼皂苷h，每次8～10g，每日3次；2组患者口服实施例4制备的中药组合物，每次8～10g，每日3次；3组患者口服实施例5制备的重楼皂苷h的中药组合物，每次8～10g，每日3次；对照组患者口服奥美拉唑颗粒，每次8～10g，每日3次，空白组患者口服安慰剂(主要由淀粉等制成)，每次8～10g，每日3次。(3)观察指标。比较5组的临床治疗效果，以及腹痛、腹泻、发热、呕吐等临床症状的改善时间。(4)疗效标准。显效：患者临床症状改善明显且趋于正常，腹泻腹痛、呕吐、发热等症状显著改善。有效：患者症状明显改善，腹泻腹痛、呕吐、发热等症状次数及量显著改善。无效：均未达到以上标准。总有效＝显效+有效实验结果如表1。表1五组患者治疗后疗效比较组别n显效有效无效总有效(％)1组20848602组201451953组2085765对照组20112765空白组2001195由以上结果可知，1组、2组、3组和对照组均对治疗胃肠炎有效果，实施例4制备的中药组合物能明显改善腹痛、腹泻、发热、呕吐等临床症状，总有效率达到95％。重楼皂苷h单独使用时效果不及胃肠炎治疗药物奥美拉唑，但是，将重楼皂苷h添加到中药组合物中，能明显增强中药组合物的治疗效果，具有很好的临床应用前景。本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。当前第1页12