本发明属于海洋生物技术海藻分子遗传学领域，主要涉及一种可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液的制备方法，并涉及一种快速鉴定海带配子体性别的方法。
技术背景
海带（saccharinajaponica）属于褐藻门（phaeophyta），褐藻纲（phaeophyceae），海带目（laminariales），海带科（laminariaceae），海带属（saccharina）；是中国重要的经济海藻，在医药、化工、食品等领域用途广泛。上世纪70年代建立了海带雌雄配子体分离和克隆技术，该项技术为海带种质资源的保护、开发及利用奠定了基础。
海带配子体克隆可长期保持其优良性状和纯度，是海带种质资源的最佳保存形式，也是海带杂交育种的材料。配子体克隆在保存过程中最大的问题是会发生雌雄混杂，原因一般包含三个方面：一是分离配子体时，某些品种或品系雌、雄配子体表型特征不明显，显微镜镜检有死角存在，导致雌雄难以区分；二是配子体克隆一般采用液相方式长期保存，更换培养液易造成配子体雌雄混杂；三是在配子体扩培工作中，因操作不当或扩培器皿消毒不完全造成雌雄混杂。海带配子体性别混杂既影响保种效率，又无法确保利用海带配子体克隆育苗获得的孢子体为所选亲本的后代，同时也给一些建立在海带配子体性别正确辨别基础上开展的分子遗传学研究带来难度。由于保存的海带配子体一般呈现为交织丝状体，利用显微镜观察很难确定配子体是否已经发生雌雄混杂；因此，亟需建立一种快速、准确、高效的鉴定海带配子体性别的方法。
随着分子生物技术的发展，特别是pcr技术和分子标记技术的日趋成熟，使得利用分子生物技术进行海带配子体性别鉴定的目标得以实现，并在实际工作中得到很好的应用。pcr技术是生物体外的特殊dna复制技术，特点是特异性强、敏感性高、对起始材料质量要求低、操作简便快速、重复性好。利用pcr技术鉴定海带配子体性别需要获得海带配子体的dna，传统的基因组dna提取方法主要包括裂解法、试剂盒法及衍生出的一系列改良方法。这些方法在准备阶段要配制各种试剂及缓冲液，样品也需要进行相应的预处理，而后还要经过抽提、沉淀、纯化等多步操作，实验步骤繁琐，费人力、财力；实验过程中使用的试剂一般都具有毒性，会对实验室环境和实验人员造成负面影响。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种海带配子体dna溶液的制备方法及性别鉴定方法，所要解决的技术问题是：第一、提供一种简捷快速并且不需要使用任何分子试剂获得可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液的制备方法，用于海带配子体的性别鉴定和一些常规的分子生物学实验；第二、建立一种海带配子体的双引物pcr扩增的性别鉴定方法，用于快速检测出海带配子体性别及是否发生雌雄混杂。
本发明的技术方案如下：
一种海带配子体dna溶液的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：海带配子体中加入灭菌的去离子水，充分研磨，经过沸水浴后室温静置，将上清液转移到灭菌离心管中，获得的上清液即为可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液。
优选地：取鲜重质量1mg~30mg的海带配子体于1.5ml灭菌离心管中，加入500μl灭菌的去离子水，充分研磨，沸水浴5~40分钟，室温静置沉淀20分钟以上，将上清液转移到灭菌离心管中，获得的上清液即为可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液。
进一步优选地：海带配子体的鲜重质量15mg~30mg；沸水浴20分钟；室温静置沉淀30分钟。
采用制备的可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液进行海带配子体的性别鉴定方法，其特征在于：以所述dna溶液为pcr模板，利用雌性特异引物hfm4和雄性特异引物msj68-16-3进行一轮双引物pcr扩增，用于多个海带品种或者品系配子体的性别鉴定及混杂现象确认。
本发明的积极效果在于：
本发明开发了一种简捷快速的、不需要使用任何分子试剂制备可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液的方法，可用于海带配子体性别的鉴定和一些常规的分子鉴定等实验；简化dna溶液制备的操作流程，省时省力；同时降低了实验的费用成本，也增加了实验的安全性。
本发明提供的这种获得dna溶液的方法中需要配子体克隆的量很少，多次实验结果显示海带配子体克隆鲜重质量在1mg以上，pcr就可以扩增出稳定明确的条带；鲜重质量15~30mg处理后pcr扩增效果最好；此方法可以避免检测中海带配子体克隆的浪费，为一些克隆量很少的海带配子体的检测提供了方便。对于部分一次性的检测任务，每次提取dna进行性别鉴定完毕之后，dna样品的存放和后置处理是一个问题；利用此种方法可以随时取样随时检测，使用后的检测液可以随时处理掉，大大节省了储样空间。
同时本发明筛选到一个海带雌配子体特异标记，针对性强，扩增效率高，稳定性好。结合实验室已开发的海带雄配子体特异标记，建立了一种海带配子体的双引物pcr扩增性别鉴定方法，经过一轮pcr扩增可以同时检测出海带配子体的性别和是否发生雌雄混杂现象，不仅使性别鉴定过程操作更简便快速，而且特异性强，错配率低，扩增效率高，稳定性好。可以达到快速、明确鉴定出海带配子体性别的目的。
本发明能够为海带育种工作提供有力工具，对推动海带配子体的育种应用研究和海带性别决定进化系统的研究具有一定意义。
附图说明
图1是海带雌、雄配子体经8种不同的处理方法得到的dna溶液的pcr扩增结果效果图：等量的雌配子体b571003010、雄配子体571202009经8种处理方式后获得的dna溶液，利用微卫星引物zpsj96进行pcr扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果；c为阴性对照；m为天根公司marker
图2是海带雌、雄配子体经不同时间长短的沸水浴处理后得到的dna溶液的pcr扩增结果效果图：等量(湿重)的雌配子体b571003010、雄配子体571202009设置沸水浴时间梯度5分钟、10分钟、20分钟、40分钟，经相同处理后获得的dna溶液，利用微卫星引物zpsj75进行pcr扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果；c为阴性对照；m为天根公司markeriii。
图3、图4、图5分别是以实施例1中试剂盒法和本发明提供的快速制备方法分别得到的海带配子体dna溶液作为模板，利用海带配子体雄性特异引物进行pcr扩增的鉴定结果效果图：实施例1中6个海带品种36个配子体，分别采用植物基因组dna提取试剂盒和本发明提供的快速制备方法得到36个海带配子体的dna溶液，利用海带配子体雄特异引物msj68-16-3进行pcr扩增进行性别鉴定检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果；c为阴性对照；m为天根公司marker
图6、图7、图8分别是以实施例1中试剂盒法和本发明提供的快速制备方法分别得到的海带配子体dna溶液作为模板，利用海带配子体雌性特异引物进行pcr扩增的鉴定结果效果图：实施例1中6个海带品种36个配子体，分别采用植物基因组dna提取试剂盒和本发明提供的快速制备方法得到36个海带配子体的dna溶液，利用海带配子体雌特异引物hfm4进行pcr扩增进行性别鉴定检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果；c为阴性对照；m为天根公司marker
图9、图10、图11分别是实施例2中分别利用海带配子体雌、雄性别特异引物进行单引物扩增和双引物扩增的效果对比图：实施例2中的15个海带配子体克隆，采用本发明提供的快速制备方法得到的海带配子体dna溶液作为模板，分别利用海带配子体雌特异引物hfm4、雄特异引物msj68-16-3、雌雄特异引物hfm4和msj68-16-3的双引物组合进行pcr扩增进行性别鉴定检测，验证双引物组合鉴定海带配子体性别的可行性。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果；c为阴性对照；m为天根公司marker
具体实施方式
下面结合具体实施例、说明书附图以及实验对比结果进一步说明本发明。
本发明建立了一种海带配子体性别鉴定方法，首先制备一种简易dna模板，利用简易dna模板，结合海带配子体雌性特异标记、雄性特异标记，建立一种双引物聚合酶链反应（pcr），可以一步快速检测出海带配子体的性别及是否发生雌雄混杂的情况。分别使用海带雌性特异标记和雄性特异标记进行两轮单引物pcr，与双引物pcr对照结果完全一致。申请人建立的双引物pcr性别检测，可一步同时检测出海带配子体的性别及是否发生雌雄混杂现象，不仅使性别鉴定过程操作更简便快速，而且特异性强，错配率低，扩增效率高，稳定性好。
（一）、可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液的快速制备
在山东东方海洋科技股份有限公司海藻中心种质保存实验室中任取海带雌雄配子体各一个，编号为b571003010（雌）、571202009（雄），对海带雌雄配子体进行不同方式处理，取1μl处理后得到的工作液作为pcr反应的模板，利用本实验室已开发的海带微卫星标记zpsj75（f:agctctctccatccttcatg、r:ggcttccggtctactctatag）、zpsj96（f:cagacgaaccttgtacagac、r:cttgtattgggcgtaggatc）作为pcr反应的引物，进行pcr扩增，pcr反应程序：94℃预变性5min；然后30个循环包括94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸10min；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。
根据电泳结果显示获得海带配子体基因组dna溶液的的优选方案如下：
1、等量的海带配子体克隆分别经过
沸水浴10分钟，离心10000g10分钟，室温沉淀30分钟。
2、海带配子体克隆量(湿重)在1mgquote
3、沸水浴时间5~40分钟，最优选为20分钟。
快速获得海带配子体基因组dna溶液的优选操作为取鲜重质量约15mg~30mg的海带配子体于1.5ml灭菌离心管中，加入500μl灭菌的去离子水，充分研磨，沸水浴20分钟，室温静置沉淀30分钟，将上清液转移到灭菌离心管中，获得的溶液即为海带配子体基因组dna溶液。
（二）、海带配子体的双引物pcr性别鉴定
1、海带雄配子体鉴定标记msj68-16-3，由青岛农业大学海洋生物科学和工程学院与山东东方海洋科技股份有限公司海藻中心分子生物学实验室共同开发的，具体参照《agenomescreenforthedevelopmentofsex-specificdnamarkersinsaccharinajaponica》，其核苷酸序列为seqidno.1。
2、本发明中海带雌配子体鉴定标记hfm4（序列未公开发表），是由本实验室开发的仅能在海带雌性配子体中扩增出稳定条带的雌性特异引物，引物序列为seqidno.2。
seqidno.1引物序列（msj68-16-3）
上游引物5’-gtggccagcctacactcact-3’
下游引物5’-ccttctcgtagcgttccttg-3’
seqidno.2引物序列（hfm4）
上游引物5’-catgccgcgacatactgata-3’
下游引物5’-acccttcaggggctcaagta-3’
3、海带配子体双引物性别鉴定的pcr反应体系（20μl）包括：去离子水11μl、2×easytaqpcrsupermixforpage（transgen，北京）5μl、雄性特异引物msj68-16-3上下游引物各0.5μl、雌性特异引物hfm4上下游引物各1μl、模板1μl；pcr反应程序：94℃预变性5min；然后30个循环包括94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。
实施例1：验证可用于pcr扩增的海带配子体dna溶液的制备方法的可行性。
由山东东方海洋科技股份有限公司海藻中心种质保存实验室提供的6个海带品种901海带（901）、早厚成海带（zhc）、奔牛海带（bn）、东方6号海带（东6）、韩国海带（hg）、连杂海带（lz），每个品种雌雄各取3个配子体，共36个配子体（配子体编号见表1）。利用两种方法获得海带配子体基因组dna溶液：一种利用天根公司的植物基因组dna提取试剂盒提取36个海带配子体dna；一种利用本发明提供的海带配子体dna溶液的快速制备的优质条件（取湿重质量约15~30mg的海带配子体于1.5ml灭菌离心管中，加入500μl灭菌的去离子水，充分研磨，沸水浴20分钟，室温静置沉淀30分钟）得到36个海带配子体的dna溶液。利用海带配子体雌性特异引物hfm4和海带配子体雄性特异引物msj68-16-3，对上述两种方法获得的36个海带配子体克隆的dna溶液进行性别鉴定检测。20μlpcr反应体系包括：去离子水12μl、2×easytaqpcrsupermixforpage（transgen，北京）5μl、上下游引物各1μl、模板1μl；pcr反应程序：94℃预变性5min；然后30个循环包括94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。
实施例1的结论：1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明采用天根公司的植物基因组dna提取试剂盒和本发明提供的海带配子体dna溶液快速制备优质条件两种方法提取的6个海带品系的36个海带配子体基因组dna溶液，分别利用海带雌性特异标记hfm4和海带雄性特异标记msj68-16-3进行性别鉴定，两种海带配子体dna溶液制备方法性别鉴定结果一致，充分验证了本发明提供的海带配子体dna溶液快速制备方法的可行性。
实施例2：验证海带配子体的双引物pcr性别鉴定的正确性。
由山东东方海洋科技股份有限公司海藻中心牟平分公司种质保存实验室提供的631301♀♂混配子体克隆、s.ang1301♀♂混配子体克隆、s.jap1301♀♂混配子体克隆、491302♀♂混、261102♀♂混；从实例1中的海带配子体样品中随机抽取5个海带雌配子体和5个海带雄配子体，共15个克隆系进行实验（配子体编号见表2）。取适量配子体克隆于1.5ml灭菌离心管中，加入500μl灭菌的去离子水，充分研磨，沸水浴20分钟，室温静置沉淀30分钟，得到15个海带配子体克隆的dna溶液。第一种方法是利用海带配子体雌性特异引物hfm4和雄性特异引物msj68-16-3，分别对15个海带配子体进行两轮pcr性别检测，20μlpcr反应体系包括：去离子水12μl、2×easytaqpcrsupermixforpage（transgen，北京）5μl、上下游引物各1μl、模板1μl；pcr反应程序：94℃预变性5min；然后30个循环包括94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。第二种方法对15个海带配子体进行一轮双引物pcr性别检测；20μlpcr反应体系包括：去离子水11μl、2×easytaqpcrsupermixforpage（transgen，北京）5μl、雄性特异引物msj68-16-3上下游引物各0.5μl、雌性特异引物hfm4上下游引物各1μl、模板1μl；pcr反应程序：94℃预变性5min；然后30个循环包括94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。
实施例2的结论：1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明分别利用海带配子体雌性特异标记、雄性特异标记对5个雌雄混海带配子体、5个雌海带配子体、5个雄海带配子体进行两轮单引物pcr扩增与一轮双引物pcr扩增，性别鉴定结果一致。海带配子体的双引物性别鉴定可以一步同时检测出海带配子体的性别及是否发生雌雄混杂的现象，使性别鉴定过程操作更简便快速、特异性强、错配率低。
由图1可知：海带雌、雄配子体经第8种处理方式-研磨、煮沸、沉淀处理获得的dna溶液进行pcr扩增效果最好。
由图2可知：海带雌、雄配子体水浴煮沸处理20分钟后获得的dna溶液进行pcr扩增效果最好。
由图3、4、5可知：试剂盒和本发明提供的快速获得海带配子体dna溶液的优选操作两种方法获得的海带配子体dna溶液，利用海带配子体雄性特异引物msj68-16-3进行pcr扩增，两种方法鉴定结果一致，验证了快速获得海带配子体dna溶液的优选操作可以用于海带雄性配子体性别鉴定的目的dna溶液的制备。
由图6、7、8可知：试剂盒和本发明提供的快速获得海带配子体dna溶液的优选操作两种方法获得的海带配子体基因组dna溶液，利用海带配子体雌性特异引物hfm4进行pcr扩增，两种方法鉴定结果一致，验证了快速获得海带配子体dna溶液的优选操作可以用于海带雌性配子体性别鉴定的目的dna溶液的制备。
由图9、10、11可知：在海带雌雄混配子体、雌配子体、雄配子体中分别利用海带配子体雌性特异引物、雄性特异引物进行两轮单引物pcr扩增与进行一轮双引物pcr扩增，性别鉴定结果一致，验证海带配子体的双引物pcr性别鉴定的正确性。