本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种复合菌系及其应用和纳米纤维素的制备方法。
背景技术
纳米纤维素，即纳米级的纤维素，被福布斯报道为“拯救世界的神奇材料”，具有很多优异性能，如表面积大、生物相容性好、来源广泛、环境友好、成本低等，纳米纤维素的重量只有钢材的1/5，强度却是其5倍以上，能广泛应用于汽车、建材、包装、化妆品、气凝胶等行业。
苎麻、红麻、黄麻、大麻、亚麻、罗布麻、蕉麻、剑麻等麻类植物，以及小麦、水稻等秸秆中含有40％-70％的纤维素以及20％-50％的胶质，是制备纳米纤维素的理想原材料。这些原材料在经过脱胶、洗涤、过滤和研磨后，即可得到纳米纤维素。
目前，常用的麻类、秸秆等草本植物脱胶方法主要有化学脱胶法和生物脱胶法。其中，化学脱胶法是利用纤维素与胶质在高温高压条件下对酸碱稳定性不同的原理去除植物中的胶质，生物脱胶法则是利用微生物分泌的酶催化降解植物中的胶质。化学脱胶虽然能够对草本植物进行高效的脱胶，但由于该方法的工艺条件苛刻，且需要使用到大量高浓度强酸碱，导致其脱胶成本和污染都较高。因此，成本相对低廉且环境友好的生物脱胶受到了越来越多的青睐，但是现有生物脱胶工艺的脱胶效率低，如何提高草本植物的生物脱胶效率，是目前亟待解决的技术难题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合菌系及其应用和纳米纤维素的制备方法，采用本发明提供的复合菌系对麻类、秸秆等草本植物进行发酵脱胶时，具有较高的效率。
本发明提供了一种纳米纤维素的制备方法，包括以下步骤：
a)提供菌液，所述菌液中含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse；
b)将所述菌液和草本植物在水中混合，进行发酵，得到发酵物；
c)将所述发酵物依次进行灭活、洗涤和过滤，得到纤维浆；
d)对所述纤维浆进行研磨，得到纳米纤维素。
优选的，步骤a)中，所述菌液中所述菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的活菌数量比为3：(1～2)。
优选的，步骤a)中，所述菌液按照以下方法制备得到：
菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse在培养液中混合培养，得到菌液。
优选的，步骤b)中，所述草本植物为草本植物颗粒；所述草本植物颗粒的粒径≤10mm。
优选的，步骤b)中，菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse在所述菌液和水组成的混合液中的总活菌量≥1×107cfu/ml；
所述草本植物占所述菌液和水总质量的5～10wt％。
优选的，步骤b)中，所述发酵的方式为在有氧条件下震荡发酵；所述发酵的温度为31～33℃；所述发酵的时间为8～12h。
优选的，步骤c)中，所述发酵物在进行灭活之前，先与naoh和h2o2混合。
优选的，步骤b)中，所述草本植物的种类包括麻类植物和/或农作物秸秆。
本发明提供了一种复合菌系，包括菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse。
本发明提供了上述技术方案所述的复合菌系在草本植物脱胶中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种复合菌系及其应用和纳米纤维素的制备方法。本发明提供的复合菌系包括菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse。相较于单一菌株，采用本发明提供的复合菌系对麻类、秸秆等草本植物进行发酵脱胶时，具有更广谱的应用范围和更高的效率。本发明提供的应用上述复合菌系制备纳米纤维素的方法包括以下步骤：a)提供菌液，所述菌液中含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse；b)将所述菌液和草本植物在水中混合，进行发酵，得到发酵物；c)将所述发酵物依次进行灭活、洗涤和过滤，得到纤维浆；d)对所述纤维浆进行研磨，得到纳米纤维素。本发明提供的方法以含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的菌液对草本植物进行发酵脱胶，能够显著提高发酵脱胶的效率，从而提升纳米纤维素生产效率。在本发明提供的优选技术方案中，草本植物在进行发酵前先研磨成颗粒，这样能够提高发酵质量，解决传统发酵不均匀、不彻底的问题，从而降低制备获得的纳米纤维素的残胶量，提升其纯度与质量。在本发明提供的另一优选技术方案中，所述发酵物先与低浓度naoh和h2o2混合，再高温灭活，在灭活了微生物的同时，还实现了发酵物中残余非纤维素(残胶)的去除，这不但进一步提高制备获得的纳米纤维素的纯度与质量，还省去了敲、打、多次洗涤等提纯纤维浆的传统工序，简化了纳米纤维素的生产工艺流程。
生物保藏材料信息说明
枯草芽孢杆菌bse，分类命名：枯草芽孢杆菌bse(bacillussubtilisbse)；于2018年07月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018483。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种纳米纤维素的制备方法，包括以下步骤：
a)提供菌液，所述菌液中含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse；
b)将所述菌液和草本植物在水中混合，进行发酵，得到发酵物；
c)将所述发酵物进行灭活、洗涤和过滤，得到纤维浆；
d)对所述纤维浆进行研磨，得到纳米纤维素。
在本发明提供的制备方法中，首先提供含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的菌液，其中，所述菊迪卡氏菌dc(dickeyachrysanthemiibfc2016，菌株保藏号：cgmcc14600)可高产果胶酶及甘露聚糖酶，所述枯草芽孢杆菌bse(bacillussubtilisbse，菌株保藏号为cctccm2018483)可高产木聚糖酶及木质素酶。在本发明中，所述菌液中菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的活菌数量比优选为3：(1～2)，具体可为3:1、3:1.1、3:1.2、3:1.3、3:1.4、3:1.5、3:1.6、3:1.7、3:1.8、3:1.9或3:2；所述菌液中菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的总活菌量优选≥1×107cfu/ml，更优选≥25×107cfu/ml，具体可≥50×107cfu/ml。在本发明中，所述菌液优选按照以下方法制备得到：
菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse在培养液中混合培养，得到菌液。
在本发明提供的上述菌液制备方法中，所述培养液优选为lb液体培养基；所述混合培养的ph值优选为6～7；所述混合培养的温度优选为30～33℃，具体可为30℃、31℃、32℃或33℃；所述混合培养的通气量优选为0.1～0.3m3/(m3·h)，具体可为0.1m3/(m3·h)、0.15m3/(m3·h)、0.2m3/(m3·h)、0.25m3/(m3·h)或0.3m3/(m3·h)；所述混合培养的搅拌速率优选为100～140rpm，具体可为100rpm、105rpm、110rpm、115rpm、120rpm、125rpm、130rpm、135rpm或140rpm。
得到菌液后，将所述菌液和草本植物在水中混合。其中，所述草本植物种类包括但不限于麻类植物和/或农作物秸秆，所述麻类植物具体可选择汉麻、苎麻、红麻、黄麻、亚麻、罗布麻、蕉麻和剑麻中的一种或多种，所述农作物秸秆具体可选择小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、薯类秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆和甘蔗秸秆中的一种或多种。在本发明中，所述草本植物优选为草本植物颗粒，所述草本植物颗粒的粒径优选≤10mm，具体可为0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm；所述水的ph值优选为6～8。在本发明中，菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse在所述菌悬液和水组成的混合液中的总活菌量优选≥1×107cfu/ml，具体可为1×107～2×107cfu/ml；所述草本植物优选占所述菌液和水总质量的5～10wt％，具体可为5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％或10wt％。在本发明中，所述菌液和草本植物在水中混合的方式优选为：先将菌液和水混合，得到稀释菌液，所述稀释菌液中菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的总活菌量优选≥1×107cfu/ml；之后，将所述稀释菌液与草本植物混合。
所述菌液和草本植物在水中混合后，进行发酵。其中，所述发酵优选在有氧条件下进行，所述有氧条件优选由压缩空气提供，所述压缩空气的流量优选为0.2～0.3m3/m3·h，具体可为0.2m3/m3·h、0.25m3/m3·h或0.3m3/m3·h，所述压缩空气的气压优选为0.2～0.3mpa，具体可为0.2mpa、0.25mpa或0.3mpa；所述发酵优选在震荡条件下进行，所述震荡的转速优选为100～140rpm，具体可为100rpm、105rpm、110rpm、115rpm、120rpm、125rpm、130rpm、135rpm或140rpm；所述发酵的温度优选为31～33℃，具体可为31℃、32℃或33℃；所述发酵的时间优选为8～12h，具体可为8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h。发酵结束后，得到发酵物。
得到发酵物，对所述发酵物进行灭活。在本发明中，所述发酵物在进行灭活之前，优选先与naoh和h2o2混合。其中，所述naoh和发酵物的用量比优选为(2～10)g：1l，具体可为2g:1l、3g:1l、4g:1l、5g:1l、6g:1l、7g:1l、8g:1l、9g:1l或10g:1l；所述h2o2和发酵物的用量比优选为(0.6～3)g：1l，具体可为0.6g:1l、0.9g:1l、1.2g:1l、1.5g:1l、1.8g:1l、2.1g:1l、2.4g:1l、2.7g:1l或3g:1l。在本发明提供的一个实施例中，所述h2o2以双氧水的形式与发酵物混合，所述双氧水中h2o2的浓度优选为10～50wt％，具体可为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％或50wt％。在本发明中，所述灭活的方式优选为高温灭活，具体温度优选为90～100℃，具体可为90℃、92℃、94℃、96℃、98℃或100℃；所述灭活的搅拌速率优选为100～150rpm，具体可为100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm或150rpm；所述灭活的时间优选为1～2h，具体可为1h、1.5h或2h。灭活结束后，得到灭活液。
得到灭活液后，对所述灭活液依次进行洗涤和过滤。其中，所述洗涤的试剂优选为清水；所述过滤的工具优选为分样筛，所述分样筛的目数优选为40～80目，具体可为40目、50目、60目、70目或80目。过滤完毕后，得到纯净的纤维浆。
得到纤维浆后，对所述纤维浆进行研磨。其中，所述研磨的方式优选为球磨；所述球磨的球料质量比优选为(10～20):1，具体可为10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1；所述球磨的球磨介质填充率优选为25～35％，具体可为25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％；所述球磨的设备优选为行星球磨机。在本发明中，所述研磨的转速优选为200～300rpm，具体可为200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm或300rpm；所述研磨的时间优选为1～3h，具体可为1h、1.5h、2h、2.5h或3h。研磨结束后，得到纳米纤维素。
本发明提供的制备方法以含有菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的菌液对草本植物进行发酵脱胶，能够显著提高发酵脱胶的效率，从而提升纳米纤维素生产效率。
在本发明提供的优选技术方案中，草本植物在进行发酵前先研磨成颗粒，这样能够提高发酵质量，解决传统发酵不均匀、不彻底的问题，从而降低制备获得的纳米纤维素的残胶量，提升其纯度与质量。
在本发明提供的另一优选技术方案中，所述发酵物先与低浓度naoh和h2o2混合，再高温灭活，在灭活了微生物的同时，还实现了发酵物中残余非纤维素(残胶)的去除，这不但进一步提高制备获得的纳米纤维素的其纯度与质量，还省去了敲、打、多次洗涤等提纯纤维浆的传统工序，简化了纳米纤维素的生产工艺流程。
本发明还提供了一种复合菌系，包括菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse。其中，所述菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的活菌数量比优选为3：(1～2)，具体可为3:1、3:1.1、3:1.2、3:1.3、3:1.4、3:1.5、3:1.6、3:1.7、3:1.8、3:1.9或3:2。在本发明提供的一个实施例中，所述复合菌系保存在复合菌系菌悬液中，所述菌悬液中菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse的总活菌量优选≥1×107cfu/ml，更优选≥25×107cfu/ml，具体可≥50×107cfu/ml。
本发明提供的复合菌系包括菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse，相较于单一菌株，采用本发明提供的复合菌系对麻类、秸秆等草本植物进行发酵脱胶时，具有更广谱的应用范围和更高的效率。
本发明还提供了一种上述技术方案所述复合菌系在草本植物脱胶中的应用。本发明提供的复合菌系包括菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse，相较于单一菌株，应用本发明提供的复合菌系对麻类、秸秆等草本植物进行脱胶具有更高的效率。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1工业大麻(汉麻)韧皮纳米纤维素制备
(1)原麻研磨粉碎
将无霉变工业大麻韧皮晒干至含水率低于10％，抖松、除杂。用植物粉碎机研磨成约2mm长的细小松散屑状粉末。
(2)菌种培养
将菊迪卡氏菌dc(dickeyachrysanthemiibfc2016)与枯草芽孢杆菌bse(bacillussubtilisbse)混合培养，制备成菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse活菌量的比例为2:1的菌悬液。培养条件：lb培养液、ph6～7、温度32℃，通气量0.2～0.3m3/(m3·h)，并以120rpm搅拌。
(3)稀释配液
在自带加热、搅拌和通气功能的发酵锅里注入自来水，并调至ph7、温度32℃±1℃；添加2wt％的菌悬液，混匀稀释成总活菌量为1×107～2×107cfu/ml的稀释液。
(4)浸泡震荡发酵脱胶
在上述装有稀释液的发酵锅中再加入占稀释液10wt％的大麻韧皮粉末。32℃±1℃、0.3mpa的压缩空气流量0.2～0.3m3/m3·h，以130rpm震荡发酵8h后，韧皮粉末柔软蓬松，残胶率3.7wt％。
(5)灭活与去残胶
发酵脱胶结束后，向发酵液加入naoh和30wt％的双氧水，naoh按照质量体积比浓度8g/l添加，双氧水按照质量体积比浓度5g/l添加；之后在100℃灭活，并以100rpm的速度搅拌。1h后，用清水洗涤，60目分样筛过滤获得纯净纤维浆，纤维素含量99wt％，白度85度。
(6)纳米纤维素制备
在280rpm、球料质量比15:1、球磨介质填充率30％的条件下，用行星球磨机研磨上述纤维浆2h，获得纳米纤维素。所述纳米纤维素呈棒杆状，直径12～25nm，长度90～186nm。
与常规高浓度碱煮、酸解方法相比，本实施例方法的纳米纤维素得率从46.2％提高到58.6％，结晶度从71.5％提高到76.1％，naoh使用量降低80～95％，强酸使用量降低100％。
实施例2苎麻全秆纳米纤维素制备
(1)原麻研磨粉碎
将无霉变大麻韧皮晒干至含水率低于10％，抖松、除杂。用植物粉碎机研磨成约5mm长的细小松散屑状粉末。
(2)菌种培养
将菊迪卡氏菌dc(dickeyachrysanthemiibfc2016)与枯草芽孢杆菌bse(bacillussubtilisbse)混合培养，制备成菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse活菌量的比例为2:1的菌悬液。培养条件：lb培养液、ph6～7、温度31℃，通气量0.2～0.3m3/(m3·h)，并以100rpm搅拌。
(3)稀释配液
在自带加热、搅拌和通气功能的发酵锅里注入自来水，并调至ph7、温度32℃±1℃；添加2wt％的菌悬液，混匀稀释成总活菌量为1×107～2×107cfu/ml的稀释液。
(4)浸泡震荡发酵脱胶
在上述装有稀释液的发酵锅中再加入占稀释液10wt％的苎麻粉末。31℃±1℃、0.3mpa的压缩空气流量0.2～0.3m3/m3·h，以140rpm震荡发酵12h后，原料粉末柔软蓬松，残胶率5.6wt％。
(5)灭活与去残胶
发酵脱胶结束后，向发酵液加入naoh和30wt％的双氧水，naoh按照质量体积比浓度10g/l添加，双氧水按照质量体积比浓度3g/l添加；之后在100℃灭活，并以120rpm的速度搅拌。2h后，用清水洗涤，50目分样筛过滤获得纯净纤维浆，纤维素含量98wt％，白度79度。
(6)纳米纤维素制备
在250rpm、球料质量比10:1、球磨质填充率25％的条件下，用行星球磨机研磨上述纤维浆2.5h，获得纳米纤维素。所述纳米纤维素呈棒杆状，直径22～31nm，长度120～216nm。
与常规高浓度碱煮、酸解方法相比，本实施例方法的纳米纤维素得率从37.6％提高到46.7％，结晶度从70.8％提高到72.9％，naoh使用量降低90％～95％，强酸使用量降低100％。
实施例3秸秆纳米纤维素制备
(1)原麻研磨粉碎
将无霉变水稻秸秆晒干至含水率低于10％，抖松、除杂。用植物粉碎机研磨成约3mm长的细小松散屑状粉末。
(2)菌种培养
将菊迪卡氏菌dc(dickeyachrysanthemiibfc2016)与枯草芽孢杆菌bse(bacillussubtilisbse)混合培养，制备成菊迪卡氏菌dc和枯草芽孢杆菌bse活菌量的比例为5:2的菌悬液。培养条件：lb培养液、ph6～7、温度32℃，通气量0.2～0.3m3/(m3·h)，并以120rpm搅拌。
(3)稀释配液
在自带加热、搅拌和通气功能的发酵锅里注入自来水，并调至ph7、温度32℃±1℃；添加4％的菌悬液，混匀稀释成总活菌量为1×107～2×107cfu/ml的稀释液。
(4)浸泡震荡发酵脱胶
在上述装有稀释液的发酵锅中再加入占稀释液8wt％的秸秆粉末。31℃±1℃、0.3mpa的压缩空气流量0.2～0.3m3/m3·h，以140rpm震荡发酵12h后，原料粉末柔软蓬松，残胶率4.6wt％。
(5)灭活与去残胶
发酵脱胶结束后，向发酵液加入naoh和30wt％的双氧水，naoh按照质量体积比浓度9g/l添加，双氧水按照质量体积比浓度6g/l添加；之后在90℃灭活，并以120rpm的速度搅拌。2h后，用清水洗涤，40目分样筛过滤获得纯净纤维浆，纤维素含量97wt％，白度74度。
(6)纳米纤维素制备
在220rpm、球料质量比20:1、球磨质填充率35％的条件下，用行星球磨机研磨上述纤维浆3h，获得纳米纤维素。所述纳米纤维素呈棒杆状，直径14～25nm，长度102～158nm。
与常规高浓度碱煮、酸解方法相比，本实施例方法的纳米纤维素得率从35.9％提高到42.2％，结晶度从71.1％提高到73.2％，naoh使用量降低89％～94％，强酸使用量降低100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。