一种稻瘟病抗性设施鉴定方法及其应用与流程

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性设施鉴定方法。

背景技术：

水稻是世界上重要的粮食作物，稻瘟病是影响水稻稳产高产的重要病害之一。稻瘟病菌由于其复杂的变异性，导致抗性基因快速失去抗性，一直受到各水稻主产区的高度关注。

福建省位于中国东南部，大部分气候属于亚热带气候。水稻种植比较集中在内陆地区的山区及丘陵地带，沿海地区比较分散并且面积相对较小。复杂的地理环境造成稻瘟病在全省各稻区均可发生，并且各地区的生理小种间差异比较明显。病情的复杂性和严重性影响着福建省水稻生产的产量和质量，严重制约了水稻育种的产业化进程。因此，选育稻瘟病抗性品种已成为当地的重要育种目标。利用抗病品种抵抗稻瘟病的流行是行之有效的安全措施，而在实际生产中，单一的抗病品种在长时间大面积种植后抗性表现为丧失，造成稻瘟病的流行和暴发，因此不断地寻找新的抗源材料并研究其抗病机制是水稻育种和抗病研究者长期的科研任务。

利用田间自然发病鉴定水稻品种（材料）的抗瘟性，虽是目前一个稳定可靠的鉴定技术，但是大田自然诱发的鉴定需在特定的温度、湿度和光照等外界条件下才能进行，显然难以满足当前的育种和科研的需求。

在室内采用一套操作简单、结果稳定的设施技术，鉴定稻瘟病的抗性，是当前科学研究或生产实践的必要条件。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种水稻稻瘟病抗性室内鉴定方法，其试验结果为品种抗性鉴定及抗性机制研究提供试验条件。

为实现上诉目的，其具体技术方案如下 ：

一种稻瘟病抗性设施鉴定方法 ，包括以下步骤：

1）接种室装备：满足稻瘟病发病和水稻生长的温度、湿度和光照要求的人工气候室；即选择一个30平米的房间，装上大1匹空调、培养架式光照系统和气库调加湿器；

2）接种菌的准备：根据试验要求选用所需生理小种的稻瘟病菌株，将带有纸片的稻瘟病菌株用燕麦培养基28℃暗培养活化3-5天，切取1~3mm×1-3mm的菌丝块，移至燕麦培养基上28℃暗培养，待菌落面积扩展至培养皿≥80%的面积时，刮去菌丝，置于37℃光照培养箱中，按光：暗=12h:12h产孢3-5天，用无菌水洗下孢子，过滤、搅匀，加入0.025% Tween 20，通过通过血球计数板计数，将悬浮液的孢子浓度调整为5×10⁵个孢子／ml备用；

3）将水稻种子在室温下用清水浸泡至露白，室温催芽12h后播种于育苗盘内，待秧苗长至三叶一心时，把生长良好的秧苗置于密封的接种桶中，桶内保水以保持湿度≥95%；按每100株秧苗喷洒30 ml孢子液，使用雾化喷头，对水稻材料进行喷洒接种稻瘟病菌，力求使整个接种桶呈均匀细雾；接种后立刻密封接种桶，并且严格遮光，于26℃ ~ 28℃保湿（RH=95%）培养24 h；

4）将接种桶上的密封薄膜和雨布去除，保存在室温25℃~30℃、RH>95 %的高湿环境下培育，5-7天后观察症状。病级调查参照标准：

0级：无病斑；

1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径为0.5mm）；

2级：有直径为0.5-1mm大小的褐色病斑；

3级：有直径为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；

4级：有长3-4mm大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；

5级：病斑达到最大（水稻品种CO39的眼状病斑最长为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死；如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。

病级统计分析：0级为免疫，1-2级为R，3级为MS，4-5级记为S。4-5级病株率﹥50%记为该水稻品种对该稻瘟病菌株为S；若4-5级病株率<50%,而3-5级病株率>50%记为该水稻品种对该稻瘟病菌株为MS；若0-2级病株率>50%记为该水稻品种对该稻瘟病菌株为R。

燕麦培养基配方为：燕麦30g，琼脂粉20g，加水定容至lL 。

一种稻瘟病抗性设施鉴定方法在水稻稻瘟病接种鉴定中的应用。

一种稻瘟病抗性设施鉴定方法在水稻稻瘟病免疫反应过程相关基因表达检测上的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用室内加湿器控制湿度，空调调节温度和光照设施提供光源，提供稻瘟病发病所需要的条件。采用雾化喷雾器设备充分接种稻瘟病菌，从而形成了一套水稻稻瘟病抗性设施鉴定的技术体系，可用于特定抗性基因与无毒基因的互作鉴定、品种抗性鉴定和抗性基因分离群体鉴定及抗性基因分子机制的研究等，另外，该技术体系方便实用，省时省力，将成为水稻稻瘟病抗性基因鉴定研究的重要基础。

附图说明

图1为气调库加湿器和设施鉴定室内景。

图2为准备的鉴定苗和放入接种桶内待接种的鉴定苗。

图3为接种桶上扣上密闭箱、雾化喷头进形雾化菌液接种。

图4为日本晴转Piz-t和日本晴接种KJ201的发病表型。

图5为水稻品种Aim-1和SSBM接种KJ201后的水杨酸代谢通路基因表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种稻瘟病抗性设施鉴定室安装与调试

选择一30平米的接种室后，按要求购置气调库加湿器、空调及光照设施，进行装置，如图1所示。

实施例2：一种稻瘟病抗性设施鉴定方法在水稻稻瘟病接种鉴定中的应用

1）接种菌的准备：选择稻瘟病菌株KJ201，将带有纸片的菌株用燕麦培养基28℃暗培养活化3-5天，切取1~3mm x 1-3mm的菌丝块，移至燕麦培养基上28℃暗培养，待菌落扩展至培养皿≥80%面积时，刮去菌丝，置于37℃光照培养箱中，按光：暗=12h:12h产孢3-5天，用无菌水洗下子孢子，过滤、搅匀，加入0.025% Tween20，通过血球计数板计数，将悬浮液的孢子浓度调整为5×10⁵个孢子／ml备用；

2）将水稻品种日本晴和日本晴转Piz-t的种子用清水浸泡至露白，室温催芽12h后播种于育苗盘内，待秧苗长至三叶一心时，把生长良好的秧苗置于密封的接种桶中，桶内保水以保持湿度≥95%；按每100株苗喷30 ml孢子液，使用雾化喷头，对水稻材料进行喷洒接种稻瘟病菌KJ201，力求使整个接种桶呈均匀细雾；接种后立刻密封接种桶，并且严格遮光，于26 ℃ ~ 28 ℃保湿（RH=95%）培养24 h；

3）将接种桶上的密封薄膜和雨布去除，保存在室温25℃~30℃、RH>95%的高湿环境下培育，5-7天后观察症状。病级调查结果：日本晴转Piz-t为0级，免疫；日本晴为5级，记为S，感病。

实施例3：一种稻瘟病抗性设施鉴定方法在水稻稻瘟病免疫反应过程相关基因表达检测上的应用

Aim-1是水稻品种SSBM中参与水杨酸合成的一个基因发生了突变的水稻品种，水杨酸合成途径涉及到水稻稻瘟病免疫反应过程相关的基因如PAL1，PR10，PR1a和PR1b的表达，本试验利用稻瘟病菌KJ201处理，结合半定量RT-PCR分析技术，分析了PAL1，PR10，PR1a和PR1在Aim-1和SSBM水稻品种中的表达情况，结果见图5。结果表明，与水稻稻瘟病免疫反应相关基因PAL1，PR10，PR1a和PR1在水稻品种Aim-1中的表达量远远低于在水稻品种SSBM中表达，试验结果吻合突变体的实际情况。

这种设施鉴定方法的一套抗性筛选技术，既避免了室外季节、环境等影响的不足，又节约了人为和物力，最终能够真实地反应水稻品种（材料）的抗稻瘟病能力，试验结果可以为推广品种抗性鉴定、品种（材料）抗性基因的挖掘和抗性分子机制研究等奠定稳定可靠的基础。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。